由牛樟芝膜內萜合酶生物合成的神秘紅沒藥烯的基因組挖掘

摘要

萜類化合物代表最大的天然產物 (NP) 結構家族，在製藥、食品和香料行業中有多種應用。它們的多樣化支架是透過萜烯合成酶（TPS）催化的線性異戊二烯底物的多步驟環化級聯生成的。紅沒藥烯奈米顆粒屬於倍半萜烯（C15），在藥物和生物燃料方面有著廣泛的應用，並在生態學中作為生物活性物質。儘管發現了一些從植物、細菌和昆蟲中合成紅沒藥烯的經典 I 類 TPS，但仍不清楚來自真菌的任何紅沒藥烯合成酶是否可以產生紅沒藥烯作為主要產物。牛樟芝（Antrodia cinnamomea）是一種擔子菌門真菌，是一種原產於台灣的藥用蘑菇，也是已知的生物活性萜類化合物的多產者，但人們對生物合成途徑中涉及的酶知之甚少。在這裡，我們應用了針對 A 的基因組挖掘方法。 cinnamomea 並發現了兩種非經典的UbiA 型TPS，它們都合成(+)-(S,Z)-α-紅沒藥烯(1 ）。據確定，兩種剪裁酶（P450 單加氧酶和甲基轉移酶）在紅沒藥烯支架上安裝了 C14-甲酯。此外，四種新的紅沒藥烯衍生物2和4-6透過釀酒酵母中的異源重建進行了表徵。我們的研究發現了產生結構多樣的紅沒藥烯奈米顆粒的酵素工具。本文是「化學和合成生物學中的反應性和機制」主題的一部分。 jpg" alt="圖1." />

圖1.

(a) 源自紅沒藥烯的NP...

圖1.

(a) 源自紅沒藥烯的NP鷹架。 (b) 結構…

圖 1.(a) 源自紅沒藥烯支架的奈米顆粒。 (b) 紅沒藥烯異構體的結構。

圖2.

tps1 和…的異源表達

圖2.

tps1 和tps2 BGC 的異源表達釀酒酵母培養 5…

圖 2. 培養 5 天的釀酒酵母中 tps1 和 tps2 BGC 的異種表現。 (a) 肉桂中 tps1 和 tps2 的 BGC； (b) 對 tps1 和 (c) tps2 基因的不同組合所產生的化合物進行 SPME-GC-MS 分析。 （線上版本彩色。）

方案1。 > 提議透過 tps1A 、 tps1H 和…的組合形成 6 的生物合成途徑 方案 1. 提出的透過 tps1A 、 tps1H 和 tps1D 組合形成 6 的生物合成途徑tps1 BGC ，來自A. cinnamomea。

圖3.

液體的LC-MS 分析...

圖3.

液體的LC-MS分析S.… 微粒體組成的體外反應 圖 3. 釀酒酵母微粒體組分與 (a) 1、(b) 的體外反應的 LC-MS 分析) 2< /b> 和(c) 3。 (d) 將甲醇與2和(e)3一起孵育16小時。 EIC，選擇性電離。 (彩色線上版本。)

圖 4.

Tps1A 活性位點驗證…

圖 4.

Tps1A 活性位點基序驗證。 (a) 胺基酸比對…

圖 4. Tps1A 活性位點基序的驗證。 (a) UbiA異戊烯基轉移酶家族的兩個保守的富含天門冬胺酸的基序和UbiA樣TPS的基序的胺基酸序列的比對。 (b)表達tps1A突變體D100A、D215A、D218A、D222A和Y155A的酵母菌的SPME-GC-MS分析。 TIC，總離子含量。 (彩色線上版本。)

圖5.

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圖5.

進行標記實驗使用 1- 13 C-鈉進行 [ 13 C 6 ]-3 標記實驗…

圖 5. 使用 1 進行 [13C6]-3 標記實驗-13C-乙酸鈉。 (a) (i) 13C標記的和(ii)未標記的15的13C-NMR譜的比較。 (b) FPP環化為1並產生3的建議機制。 (彩色線上版本。)

圖 6.

功能驗證...

圖 6.

Tps1H 和 Tps1D 功能驗證。體外 LC-MS 圖譜...

圖 6. Tps1H 和 Tps1D 功能的驗證。 (a) Tps1H 將 1 轉化為 5 和 (b) Tps1D 將 5 轉化的體外反應的 LC-MS 圖譜> 至6。 />

圖7.

Tps1A 和…的系統發育分析

圖7.

Tps1A 和Tps2A 紅沒藥烯合成酶的系統發育分析和UbiA 型TPS，UbiA…

圖7. Tps1A 和Tps2A 紅沒藥烯合成酶和UbiA 型TPS、膜內異戊烯基轉移酶的UbiA 超家族和來自不同生物體的完整膜TPS 的系統發育分析。