牛樟芝的奈米修飾具有抗發炎作用並提高肌源性祖細胞的遷移潛力
摘要
骨骼肌祖細胞的增生和遷移是肌肉生成的關鍵階段。識別有助於肌肉生成的候選藥物可以對萎縮的肌肉產生正面影響。本研究的目的是合成牛樟芝 (AC)-β-環糊精 (BCD) 包合物 (IC)，並了解其對小鼠骨骼 C2C12 成肌細胞的體外促進再生影響。該 IC 接受了各種奈米表徵研究。合成螢光 IC 是為了了解 IC 的細胞攝取情況。此外，在小鼠 C2C12 骨骼肌細胞上也測試了 25 µg/mL、12.5 µg/mL 和 6.25 µg/mL IC 的抗發炎、促遷移和促增殖作用。 IC 的細胞內化會透過胞飲作用迅速發生。 IC（大小為 252.6 ± 3.2 nm，表面電荷為 -37.24 ± 1.55）透過抑制白血球介素 6 的分泌表現出抗發炎作用，並增強細胞增殖並具有良好的細胞相容性。 12.5 μg/mL劑量的IC在24小時內促進細胞遷移，但相同劑量的AC顯著降低細胞遷移，顯示BCD進行了修飾。分子研究表明，IC 透過上調長非編碼 RNA (lncRNA) NEAT-1、SYISL 和活化 pPKC/β-catenin 路徑來促進 C2C12 成肌細胞遷移。我們的研究是第一份關於 BCD 修飾的 AC 萃取物的促增殖和促遷移作用的報告。 /12/cells-11-02512-g001.jpg" alt="圖1" />
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圖1
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圖1 (A ) IC 合成示意圖(B) AC（棕色）和BCD（白色）乙醇萃取物共蒸發形成IC （黃色的）。 (C) BCD、AC 和 IC 的水溶性分析。 (D) 不同濃度IC的水溶性分析。使用 (E) BCD、(F) AC (G) 和 (H) IC 進行形態分析掃描電鏡。
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TGA（藍色）/DSC（紅色）分析（ A ) BCD, ( B ) AC,…
圖2 (A) BCD, (B) 的TGA（藍色）/DSC （紅色）分析）交流電和（C）積體電路。 (D) IC、(E) BCD 和 (F) AC 的 FT-IR 光譜分析。 (G) BCD、AC（藥物）和 IC 的合併 FT-IR 光譜。
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( A ) BCD的紫外可見光吸收光譜、交流電和積體電路。 ( B…
圖 3 (A) BCD、AC 和 IC 的紫外-可見光吸收光譜。(B) In AC和IC 在PBS (pH 7.4) 中的體外溶離曲線(C) BCD、AC 和IC 的螢光光譜
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圖 4 < /p>
較低濃度的IC 表現出細胞相容性並改善增殖( A ) C2C12…
圖4 較低濃度的IC 表現出細胞相容性並改善增殖(A) b>) C2C12 成肌細胞在 MTT 暴露前分別以 BCD 和 IC 處理 24 小時，並在 570 nm 處進行分光光度測量。 (B) C2C12成肌細胞用IC處理，孵育24小時，並使用台盼藍排除法計數以評估細胞增殖。所有實驗重複三次，數據以平均值±標準差表示； n＝3。 0.05，p＜0.05 0.01，且p＜0.01與對照組相比，分別為 0.001（雙尾 t 檢定）。
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C2C12 成肌細胞經由胞飲作用途徑內化IC。 AO-IC 的細胞內化為…
圖 5 C2C12 成肌細胞經由胞飲作用途徑內化 IC。透過螢光顯微鏡分析 AO-IC 的細胞內化隨時間的變化。 (A) 0 分鐘，(B) 5 分鐘，(C) 30 分鐘，(D) 120分鐘，(E) 180 分鐘。 (F) AO-IC 細胞攝取的 FACS 分析。 (G) AO-IC 細胞內化相對於時間測量的 CTCF 和 (H) 測量的平均螢光強度。 (I) 用或不用秋水仙鹼和高滲透壓蔗糖處理的 C2C12 成肌細胞的螢光顯微圖像，然後進行 AO-IC 孵育 2 小時。 (J) 內吞抑制劑處理後 AO-IC 內化時測量的 CTCF。 (K) FACS 分析和 (L) 內吞作用抑制劑處理後 AO-IC 細胞內化後的平均螢光強度測量。研究重複3次，結果以平均值±標準差表示； n＝3。 0.05，p＜0.05 0.01，且p＜0.01與對照組相比，分別為 0.001（雙尾 t 檢定）。
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IC 表現出抗發炎活性，並抑制C2C12 成肌細胞中IL-6 的產生。 p> 圖6 IC 表現出抗發炎活性並抑制 C2C12 成肌細胞中 IL-6 的產生。 (A) 不同濃度IC抑制蛋白質變性的能力。 (B) 以 100 ng/mL LPS 刺激 24 小時，C2C12 成肌細胞中促發炎細胞因子的產生。為了產生 IL-1β，LPS 刺激的細胞被 ATP 進一步活化。細胞以濃度 25 µg/mL、12.5 µg/mL 和 6.25 µg/mL 的 IC 和 AC 處理 (C) 30 分鐘和 (D) 3 小時。 100 ng/mL LPS 刺激24 小時。 (E) IC 和 AC 對 C2C12 肌管中 IL-6 的抑製作用。達到所需的匯合度後，將 C2C12 成肌細胞切換至 2% HS 培養基以開始分化。分化 8 天后，對 C2C12 肌管進行 IC 和 AC 處理 3 小時，然後以 100 ng/mL LPS 刺激 24 小時。以ELISA測定培養物上清液中的IL-6含量。研究重複3次，結果以平均值±標準差表示； n＝3。 0.05，p＜0.05 0.01且p＜0.01與對照組相比，分別為 0.001（雙尾 t 檢定）。使用單因子變異數分析（Dunnett 多重比較檢定）進行組間統計比較。 abc 表示組間有顯著差異。統計上不同的組別由不同的字母和不同的字母組表示。相似的字母和相似的字母組表示它們之間沒有統計差異。 
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< p> IC影響lncRNAs表現…圖7
IC影響lncRNAs表現促進C2C12遷移與增生…
圖7 IC影響lncRNAs表現促進C2C12遷移與增生…< /p> 圖7 IC影響lncRNAs表現促進C2C12遷移與增生…促進C2C12成肌細胞的遷移與增生。以 6.25 µg/mL、12.5 µg/mL 和 25 µg/mL (A) AC 和 (B) IC 處理的成肌細胞進行傷口癒合測定使用顯微鏡觀察時間（0小時、6小時、12小時、18小時和24小時）。計算用 (C) AC 和 (D) IC 處理的成肌細胞相對於時間的細胞遷移百分比。以RT-PCR研究分析IC對C2C12成肌細胞中lncRNA表現的影響。細胞以 25 µg/mL IC 處理，然後進行 LPS 處理、RNA 萃取和 cDNA 合成。進行 RT-PCR 分析以確定 IC 對 (E) lncRNA NEAT-1、(F) lncRNA SYISL 和 (G< /b>) lncRNA MEG- 3 表達。 (H) 以蛋白質印跡分析研究了IC對遷移蛋白表現的影響。研究重複3次，結果以平均值±標準差表示； n = 3。統計上不同的組別由不同的字母和不同的字母組表示。相似的字母和相似的字母組表示它們之間沒有統計差異。
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C2C12 成肌細胞中IC 觸發的訊號路徑示範。
圖8 C2C12成肌細胞中IC觸發的訊號路徑展示。 所有人物 (8)