牛樟芝低聚醣透過促進 O-GlcNA 酰化和抑制 p38/Akt 磷酸化來抑制脂多醣誘導的炎症

摘要

牛樟芝 (AC) 是一種生長於台灣的食用菌，具有多種健康益處。本研究旨在探討 AC 寡糖對脂多醣 (LPS) 誘導的體外和體內發炎反應的潛在抑製作用。透過三氟乙酸降解，AC多醣在90℃（ACHO）或25℃（ACCO）下製備了兩種寡糖產物，它們表現出不同的寡糖特性。與 ACCO 相比，ACHO 對 LPS 誘導的巨噬細胞中促發炎細胞因子（包括 IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α 和 MCP-1） mRNA 表現具有較好的抑製作用。此外，ACHO 顯著抑制了注射 LPS 的 C57BL/6 小鼠肺組織的發炎。潛在的抗發炎分子機制可能與促進蛋白質O-GlcNAcylation有關，這進一步偏向於顯著抑制p38和Akt磷酸化。我們的研究結果表明，AC寡糖對發炎的抑製作用可能是預防發炎相關疾病的有效方法。 /12/molecules-23-00051-g001.jpg" alt="圖1" />

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牛樟芝的UPLC-MS 分析…

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牛樟芝(AC) 多醣在90 °C (ACHO) 或25… 下的UPLC-MS 分析

圖1 牛樟芝(AC) 的UPLC-MS 分析90 °C ( ACHO) 或25 °C (ACCO) 下的多醣體。 (A) ACCO聚合度鑑定； (B) ACHO聚合度鑑定。 Hex代表己糖。

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< p> ACCO 和ACHO 的影響…

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ACCO 和ACHO 對脂多醣(LPS) 刺激的活力和發炎反應的影響…

圖 2 ACCO 和ACHO 對脂多醣(LPS) 刺激的巨噬細胞的活力和發炎反應的影響。 (A) RAW264.7 細胞以 LPS (200 ng/mL)、ACCO (100 µg/mL) 或 ACHO (100 µg/mL) 處理 24 小時。之後以MTT法檢測細胞活力； (B–F) RAW264.7 細胞以 ACCO (100 µg/mL) 或 ACHO (100 µg/mL) 預處理 12 小時，然後暴露於LPS (200 ng/mL) 6 小時。接下來，IL-6 (B)、IL-8 (C)、IL-1β (D)、TNFα ( E) 和MCP-1 (F) 以RT-PCR 分析進行測定。數據為平均值±SD (n = 3)。不同上標字母的數據差異顯著(p＜0.05)。

圖3

< p> ACHO 對…的抑制

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ACHO 對…中MAPK 和Akt 訊號路徑活化的抑製作用

圖3 ACHO 對活化的抑製作用LPS誘導的巨噬細胞中MAPK 和Akt 訊息傳遞路徑的影響。 RAW264.7 細胞在不含 FBS 的培養基中以 ACHO (100 µg/mL) 預處理 12 小時，然後暴露於 LPS (200 ng/mL) 30 分鐘。之後收集細胞並檢測p38（A）的磷酸化程度； ERK1/2 (B);以蛋白質印跡法測定 JNK (C) 和 Akt (D)。數據代表平均值±SD (n = 3)。不同上標字母的數據差異顯著(p＜0.05)。

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< p> LPS 和ACHO 的影響...

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LPS 和ACHO 對巨噬細胞中蛋白O -GlcNAc 醯化的影響。 (…

圖4 LPS 和ACHO 對巨噬細胞中蛋白質O-GlcNAcNA 酰化的影響。(A) 用LPS (200 ng/mL) 處理RAW264.7 細胞0– 8 h; (B) RAW264.7細胞以ACHO (100 µg/mL)預處理12 h，然後暴露於LPS (200 ng/mL) 8 h後，收集細胞。印跡分析。 23-00051-g005.jpg" alt="圖5" />

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MAPK 與Akt 的抑制...

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LPS 誘導的巨噬細胞中蛋白O-GlcNA 酰化抑制MAPK 和Akt 磷酸化…

圖5 LPS 誘導的巨噬細胞中蛋白O-GlcNA 酰化抑制MAPK 和Akt 磷酸化。 (A,B) RAW264.7 細胞以 Thi G (50 nM)、6-diazo-5-oxo-l-norleucine (DON) (5 μM ) 或ACHO (100 μg/mL) 在不含FBS 的培養基中培養12 小時，然後暴露於LPS (200 ng/mL) 30 分鐘。之後收集細胞，並進行蛋白質印跡分析； (C) RAW264.7 細胞在不含 FBS 的培養基中以 ACHO (100 μg/mL) 預處理 12 小時，然後暴露於 LPS (200 ng/mL) 30 分鐘。然後，O-GlcNAc 酰化蛋白被 WGA-瓊脂糖拉下來，並使用針對 p38、Akt 或 p-Akt 的抗體捕獲。數據代表平均值±SD (n = 3)。不同上標字母的數據差異顯著(p＜0.05)。

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< p> ACHO 對MAPKs 的影響，…

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ACHO 對肺部中MAPKs、Akt 和蛋白O -GlcNAc 酰化的影響…

圖6 ACHO 的影響注射 LPS 的小鼠肺組織中 MAPK、Akt 和蛋白質 O-GlcNAc 醯化的影響。 (A) ACHO對LPS注射後肺組織MAPKs和Akt活化的抑製作用； (B) ACHO 對 LPS 注射後肺組織中蛋白質 O-GlcNAcNA 酰化減少的逆轉。 C57BL/6 小鼠以 ACHO（1 mg/mL 飲用水）預先處理兩週，然後腹腔內注射 LPS（3 mg/kg）24 小時。之後，對小鼠實施安樂死，並收集肺組織進行蛋白質印跡分析。數據代表平均值±SD (n = 5)。不同上標字母的數據差異顯著(p＜0.05)。

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< p> ACHO 對轉錄活化的影響...

圖7

ACHO 對促發炎細胞因子( A )、巨噬細胞轉錄活化的影響... 圖7 ACHO對促發炎細胞激素轉錄活化（A）、巨噬細胞浸潤（B）和蛋白質O-GlcNAc糖基化（C）的影響b>）注射 LPS 的小鼠的肺組織中。 C57BL/6 小鼠以 ACHO（1 mg/mL 飲用水）預先處理兩週，然後腹腔內注射 LPS（3 mg/kg）24 小時。之後，將小鼠安樂死，收集肺組織進行RT-PCR檢測或免疫化學檢測。 (A) LPS注射小鼠肺組織促發炎細胞因子在mRNA層級的表達，包括IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和MCP-1； (B) ACHO 對 LPS 注射小鼠肺組織中 CD68（分化簇 68）產生的影響（×200）； (C) ACHO 對 LPS 注射小鼠肺組織中蛋白質 O-GlcNAc 醯化的影響 (×200)。數據代表平均值±SD (n = 5)。不同上標字母的數據差異顯著（p＜0.05）。

圖8

< p> ACHO 示意圖...

圖8

ACHO 抑制LPS 誘導的發炎示意圖。 (1) LPS誘導過度表現…

圖8 ACHO抑制LPS誘導的發炎反應示意圖。 (1) LPS透過上調p-p38和p-Akt誘導IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和MCP-1在mRNA水準上過度表現； (2) ACHO促進蛋白質O-GlcNAc酰化，進一步抑制p38和Akt的磷酸化，進而抑制LPS介導的發炎。 所有人物 (8)