從牛樟芝中分離出的麥角固醇可抑制小膠質細胞和 ICR 小鼠中 LPS 誘導的神經發炎反應

摘要

小膠質細胞活化引起的發炎在神經退化性疾病中很重要。在本研究中，我們試圖透過篩選天然化合物庫來尋找安全有效的抗神經發炎藥物，發現麥角固醇可以抑制脂多醣誘導的活化B細胞（NF-κB）路徑的核因子κ輕鏈增強子(LPS ) 在小膠質細胞中。據報導，麥角固醇是一種有效的抗發炎劑。然而，麥角固醇在神經發炎反應中的潛在調節作用尚未被充分研究。我們進一步研究了麥角固醇在體外和體內調節 LPS 誘導的小膠質細胞活化和神經發炎反應的機制。結果表明，麥角甾醇可以顯著降低BV2 和HMC3 小膠質細胞中LPS 誘導的促炎細胞因子，其機制可能是透過抑制NF-κB、蛋白激酶B (AKT) 和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK ) 訊號通路。此外，我們在註射 LPS 後以安全濃度的麥角固醇治療癌症研究所 (ICR) 小鼠。麥角固醇治療顯著降低小膠質細胞活化相關的離子鈣結合接頭分子 1 (IBA-1)、NF-κB 磷酸化和促發炎細胞因子水平。此外，麥角固醇預處理透過恢復突觸蛋白的表達，明顯減少了 LPS 誘導的神經元損傷。我們的數據可能有助於深入了解神經發炎性疾病的可能治療策略。 -02406-g001。 /p>

麥角固醇抑制LPS 處理誘導的小膠質細胞發炎。 ( A ) BV2…

圖 1 麥角固醇抑制 LPS 治療誘導的小膠質細胞發炎。 (A) BV2細胞以天然化合物預處理2.5小時，然後加入LPS，終濃度為1 μg/mL。 30分鐘後，以Western blot檢測p-P65、p-P38、p-JNK和p-AKT的蛋白質量。 (B–D) BV2細胞與麥角固醇一起孵育2.5小時，然後加入LPS。 6 h後，qRT-PCR檢測IL-1β、TNF-α、IL-18 mRNA量。 (E)在HMC3細胞中進行相同的實驗步驟，透過qRT-PCR檢測IL-1β、TNF-α和IL-18的mRNA量。 (F,G) BV2和HMC3細胞用麥角固醇或SP600125預處理2.5小時，然後用LPS刺激22小時； Western blot用於測定INOS和COX-2的蛋白質量。 (H) 麥角固醇的化學名稱和結構。 (I) BV2 和 HMC3 細胞接種在 96 孔板上，然後用麥角固醇 (0、5、10、30、50、100 μM) 處理 24 小時。使用 Cell Counting Kit-8 (CCK8) 測定法評估細胞活力。所有數據均為三次重複值的平均值±SEM。使用單因子變異數分析和 t 檢定分析統計顯著性。 # 與對照顯著不同； * 與 LPS 處理組顯著不同。意義：## p < 0.01，####p < 0.0001，* p < 0.05，**p＜0.05 0.01，***p＜0.01 0.001，**** p < 0.0001。

圖2

< p> 麥角固醇抑制…的活化

圖2

麥角固醇抑制BV2 與HMC3 細胞中NF-κB 訊號路徑的活化…

圖2 麥角固醇抑制…的活化LPS 刺激的 BV2 和 HMC3 細胞中的 NF-κB 訊息傳遞路徑。 BV2和HMC3細胞以麥角固醇預處理2.5小時，然後LPS刺激（1μg/mL）30分鐘；收集細胞並裂解用於蛋白質檢測，或純化細胞RNA用於qRT-PCR測定。 (A–D)Western blot檢測細胞裂解液中P65和p-P65的蛋白質量。肌動蛋白作為內務對照。 (E,F)以qRT-PCR檢測IL-1β mRNA量。 (G) 以抗 P50 抗體（綠色）和 Hoechst 細胞核染色（藍色）進行免疫染色，檢測 BV2 細胞中 NF-κB P50 (P50) 的表達和定位。用螢光顯微鏡觀察並記錄影像；比例尺為 20 μm。所有數據均為三次重複值的平均值±SEM。使用單因子變異數分析和 t 檢定分析統計顯著性。 # 與對照顯著不同； * 與 LPS 處理組顯著不同。意義： # p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.01，####p < 0.0001，* p < 0.05，**p＜0.05 0.01，****p＜0.01 0.0001。

圖3

< p> 麥角固醇抑制…的活化

圖3

麥角固醇抑制BV2 中MAPK 和AKT 訊號路徑的活化…

圖3 麥角固醇抑制LPS 刺激的BV2和HMC3 細胞中的MAPK 和AKT 訊息傳遞路徑。 (A,C) BV2 小膠質細胞在指定濃度的麥角固醇下預處理 2.5 小時，然後用 LPS (1 μg/mL) 刺激 30 分鐘。以蛋白質印跡法測定 BV2 細胞中 P38、p-P38、JNK、p-JNK、AKT 和 p-AKT 的蛋白質量。肌動蛋白作為內務對照。 (B,D) 對 HMC3 細胞進行了類似的實驗。所有數據均為三次重複值的平均值±SEM。使用單因子變異數分析和 t 檢定分析統計顯著性。 # 與對照顯著不同； * 與 LPS 處理組顯著不同。意義： # p < 0.05，## p < 0.01，####p < 0.0001，* p < 0.05，**p＜0.05 0.01，***p＜0.01 0.001，**** p < 0.0001。

圖4

< p> 麥角固醇顯著減少LPS 刺激的小膠質細胞...

圖4

麥角固醇顯著減少ICR 小鼠中LPS 刺激的小膠質細胞活化和炎症。 ( A…

圖4 麥角固醇顯著降低了ICR 小鼠中LPS 刺激的小膠質細胞活化和發炎。(A) ICR 小鼠每天注射麥角甾醇(25 mg) /kg，50mg/kg，腹腔注射）或載體（PBS，腹腔注射）5天，然後注射LPS（5mg/kg，腹腔注射）或PBS 24小時，然後對小鼠進行灌注與固定。 LPS）。小鼠。 b>F) 以蛋白質印跡法測定p-P65、IL-6 和IBA-1 蛋白質濃度作為內務對照（Nacl，n = 3 隻小鼠； LPS，n = 3 隻小鼠； ELT-L，n = 3 隻小鼠； ELT-H，n = 3 隻小鼠）。 (G)以密度測定法計算蛋白質與肌動蛋白的相對表現量。 (H,I)以ELISA法檢測血漿中IL-1β、IL-6蛋白濃度。 (J)以Griess法檢測血漿中NO的表達量。使用單因子變異數分析和 t 檢定分析統計顯著性。 # 與對照顯著不同； * 與 LPS 處理組顯著不同。意義： # p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.001，#### p < 0.0001，* p < 0.05，**p＜0.05 0.01，***p＜0.01 0.001，且****p＜0.001 0.0001。

圖4

< p> 麥角固醇顯著減少LPS 刺激的小膠質細胞...

圖4

麥角固醇顯著減少ICR 小鼠中LPS 刺激的小膠質細胞活化和炎症。 ( A…

圖4 麥角固醇顯著降低了ICR 小鼠中LPS 刺激的小膠質細胞活化和發炎。(A) ICR 小鼠每天注射麥角甾醇（25 mg） /kg，50mg/kg，腹腔注射）或載體（PBS，腹腔注射）5天，然後注射LPS（5mg/kg，腹腔注射）或PBS 24小時，然後對小鼠進行灌注與固定。 LPS）。小鼠。 b>F) 以蛋白質印跡法測定p-P65、IL-6 和IBA-1 蛋白質濃度作為內務對照（Nacl，n = 3 隻小鼠； LPS，n = 3 隻小鼠； ELT-L，n = 3 隻小鼠； ELT-H，n = 3 隻小鼠）。 (G)以密度測定法計算蛋白質與肌動蛋白的相對表現量。 (H,I)以ELISA法檢測血漿中IL-1β和IL-6蛋白濃度。 (J)以Griess法檢測血漿中NO的表達量。使用單因子變異數分析和 t 檢定分析統計顯著性。 # 與對照顯著不同； * 與 LPS 處理組顯著不同。意義： # p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.001，#### p < 0.0001，* p < 0.05，**p＜0.05 0.01，***p＜0.01 0.001，且****p＜0.001 0.0001。

圖5

< p> 麥角固醇顯著減少LPS 誘導的神經元…

圖5

麥角固醇顯著減少ICR 小鼠中LPS 誘導的神經元損傷。 ( A )…

圖 5 麥角固醇顯著減少 ICR 小鼠中 LPS 誘導的神經元損傷。 (A) 以蛋白質印跡法測定小鼠皮質中的 PSD95、Synapsin-1 和 Synaptophyn 蛋白質量。肌動蛋白作為管家對照（Nacl，n = 3 隻小鼠；LPS，n = 3 隻小鼠；ELT-L，n = 3 隻小鼠；ELT-H，n = 3 隻小鼠）。 (B) 光密度法用於估計此蛋白與肌動蛋白相比的相對表現量。 (C,D) 對抗 Synapsin-1 抗體進行免疫組織化學分析。 DAPI 被用作細胞核的標記。對皮質或海馬區域的Synapsin-1 相對螢光強度進行定量分析（Nacl，n = 8 隻小鼠；LPS，n = 8 隻小鼠；ELT-L，n = 8 隻小鼠；ELT-H，n = 8 隻小鼠）。所有數據均為三次重複值的平均值±SEM。使用單因子變異數分析和 t 檢定分析統計顯著性。 # 與對照顯著不同； * 與 LPS 處理組顯著不同。意義： # p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.001，*p＜0.001 0.05，**p＜0.05 0.01，且***p＜0.01 0.001。