從牛樟芝中分離出的 Antcin-H 部分透過 FAK-ERK-C/EBP-β/c-Fos-MMP-7 路徑失活抑制腎癌細胞侵襲

圖

圖1

< p>antcin-H的生長抑制...

圖1

antcin-H的生長抑製作用。 (a)antcin-H的化學結構。 (b) 人類…

圖1antcin-H的生長抑製作用。 (a)antcin-H的化學結構。 (b)以不同濃度（0、20、50、100、200和300μM）的antcin-H處理人RCC 786-0細胞24和48小時。孵育後，使用相差顯微鏡（上圖）研究細胞形態。比例尺，100 μm。以台盼藍染料排除法（下圖）測定細胞活力。

圖2

抑制細胞遷移和...

圖2

antcin-H 體外抑制細胞遷移和調節遷移相關蛋白。 H對遷移相關蛋白的調節。 (a) 將 786-0 細胞在不加或加 20、50、100 和 200 μM antcin-H 的情況下處理 24 小時，然後將細胞接種到 Transwell 的上部。 16小時後，將過濾器底部的細胞進行顯微拍照併計數。數據表示為三個獨立實驗的平均值±SD。具有統計顯著性，***p < 0.001。比例尺，100 μm。 (b)antcin-H 對 FAK、樁蛋白、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的調節。將 786-0 細胞在不加或加 20、50 和 100 μM antcin-H 的情況下處理 24 小時，然後分離蛋白質裂解物。以蛋白質印跡分析檢查磷酸化-FAK、磷酸化-樁蛋白、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的含量。 β-肌動蛋白作為內部上樣對照。 (c) 磷酸化-FAK 和 (d) 磷酸化-樁蛋白的共焦成像。 786-0個細胞用或不用100μMantcin-H處理24小時。使用磷酸化FAK和磷酸化樁蛋白特異性抗體以免疫螢光染色檢查磷酸化FAK和磷酸化樁蛋白的細胞分佈。透過共聚焦顯微鏡研究免疫反應影像。比例尺，20 μm。

圖 3

抑制傷口癒合與破壞…

圖3

antcin-H 抑制傷口癒合和破壞片狀足形成。 (a) 活細胞…

圖 3antcin-H 抑制傷口癒合並破壞片狀足形成。 (a) 傷口癒合前緣的活細胞延時影像。 786-0 細胞在玻璃蓋玻片上培養至 100% 匯合。形成傷口後，加入不含或含100μMantcin-H的新鮮培養基。允許細胞遷移；在 4 小時和 8 小時觀察活細胞成像的延遲。比例尺，20 μm。 (b) 使用 FAK 或 (c) 樁蛋白抗體進行免疫染色。受傷8小時後，固定遷移的細胞，並使用抗磷酸化FAK和抗磷酸化樁蛋白抗體進行免疫螢光染色。透過共焦顯微鏡記錄免疫反應影像。箭頭，形成片狀足。比例尺，20 μm。

圖4

ANTCIN- H 防止入侵並調節...

圖4

ANTCIN-H 防止入侵並調節MMPs 基因表現。 (a) 768-0細胞經過預處理…

圖4ANTCIN-H防止侵襲並調節MMPs基因表現。 (a) 將768-0 細胞用或不用20、50、100 和200 μM antcin-H 預處理24 小時，然後在沒有或有antcin-H 的情況下接種到基質膠包被的Transwell 裝置中再處理24 小時。孵育後，將侵入的細胞用吉姆薩溶液染色並使用顯微鏡計數。比例尺，100 μm。數據表示為三個獨立實驗的九個重複的平均值±SD。 ***p < 0.001 與對照組相比。 (b) MMP 和 TIMP 基因表現的即時 PCR 分析。將細胞用或不用20、50和100μM antcin-H處理24小時。處理後，從786-0細胞中提取的RNA進行即時PCR。 β-肌動蛋白作為內部對照。數據表示為三個獨立實驗的平均值±SD。具有統計顯著性，*p < 0.05，*p＜ 0.01，且 ***p < 0.001。

圖 5

抑制Src 、FAK 和…

圖5

antcin-H 對Src、FAK 和ERK1/2 訊息傳遞路徑的抑制。 (a) 時間過程依賴性…

圖 5 antcin-H 對 Src、FAK 和 ERK1/2 訊號路徑的抑制。 (a) 隨時間變化的實驗。 786-0細胞用或不用100μMantcin-H處理4、8和24小時。 (b) 劑量依賴性實驗。將細胞用或不用20、50和100μM antcin-H處理24小時。孵育後，分離總蛋白裂解物；進行蛋白質印跡分析以檢查磷酸化-Src、磷酸化-FAK、磷酸化-ERK1/2、磷酸化-C/EBP-β和c-Fos的水平。 β-肌動蛋白作為內部上樣對照。

圖6

抑制c -Fos 和C/EBP-β…

圖6

抑制參與antcin-H 介導的MMP-7 下調的c-Fos 和C/EBP-β 活性。 (a) 報告者…

圖 6 抑制與 antcin-H 介導的 MMP-7 下調有關的 c-Fos 和 C/EBP-β 活性。 (a) 報告螢光素酶測定。以含有MMP-7啟動子+1~-1500區域的報告載體或對照載體瞬時轉染786-0細胞24小時，然後用或不加20、50和100μM antcin-H處理細胞另外24小時。孵育後，測量螢光素酶活性，並將相對螢光素酶活性表示為平均值±SD。具有統計顯著性，*p < 0.05，*p＜ 0.01，且 ***p < 0.001。 (b) 假設的 c-Fos 和 C/EBP-β 結合位點位於 MMP-7 啟動子上游。 (c) Antcin-H 阻止 c-Fos 和 C/EBP-β 與 MMP-7 上游啟動子/反應元件區域結合。將786-0細胞在不加或加100μMantcin-H的情況下處理24小時，收集細胞，然後進行ChIP測定。 (d) Antcin-H 劑量依賴性地抑制 c-Fos 和 C/EBP-β 與 MMP-7 上游啟動子/反應元件區域的結合。將786-0細胞在不加或加20、50和100μM antcin-H的情況下處理24小時，收集細胞，然後檢測c-Fos和C/EBP-β與位於透過ChIP 測定確定MMP-7 啟動子上游。

圖7

原理圖模型所提出的...

圖7

所提議的參與抑制細胞遷移的訊號路徑的示意圖模型和...

圖7 所提議的參與抑制的訊號路徑的示意圖模型antcin-H 在人類 RCC 786-0 細胞的細胞遷移和侵襲。 Antcin-H 抑制 Src、FAK 和 ERK1/2 磷酸化激活，進而降低樁蛋白、c-Fos 和 C/EBP-β 活性，減少 c-Fos 和磷酸化-C/EBP-β 與 AP- 的結合1和C/EBP-β 反應元件，進而降低MMPs 基因表達，尤其是MMP-7。 MMP-7 的下調以及 TIMP-3 和 TIMP-4 基因表現的上調可阻止細胞外基質蛋白的降解並損害細胞侵襲。此外，減少樁蛋白磷酸化和波形蛋白表現可防止 786-0 細胞運動。 所有人物 (7)