4-乙醯蒽醌醇 B 在模擬微重力模型中透過抑制自噬途徑來抑制破骨細胞生成

摘要

太空人在太空任務中每月會遭受 1-2% 的骨質流失。靶向破骨細胞分化被認為是在微重力（μXg）下預防骨質疏鬆症的有前途的策略。 4-乙醯蒽醌醇 B (4-AAQB) 是一種來自牛樟芝的泛醌，具有抗發炎和抗肝癌活性。然而，4-AAQB 對 μXg 誘導的破骨細胞生成的影響仍不清楚。在本研究中，我們旨在探討μXg條件下4-AAQB對破骨細胞形成的機制影響。將單核細胞/巨噬細胞樣細胞系RAW264.7 暴露於模擬μXg（旋轉細胞培養系統；Synthecon，休士頓，德州，美國）24 小時，然後以4-AAQB 或阿崙膦酸鈉(ALN) 和破骨細胞分化因子受體處理核因子 kappa-B 配體 (RANKL) 活化劑。使用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、肌動蛋白環螢光染色、骨吸收和蛋白質印跡分析分析破骨細胞生成、骨吸收活性和破骨細胞分化相關訊號路徑。根據TRAP染色、肌動蛋白環染色和骨吸收測定的結果，我們發現4-AAQB顯著抑制μXg誘導的破骨細胞分化。破骨細胞分化的關鍵調節因子，包括活化 T 細胞胞漿核因子 1 (NFATc1)、c-Fos 和樹突細胞特異性跨膜蛋白 (DC-STAMP) 持續減少。同時，也觀察到破骨細胞凋亡和細胞週期停滯以及自噬抑制。有趣的是，自噬抑制劑 3-甲基腺嘌呤 (3-MA) 和氯奎 (CQ) 顯示出與 4-AAQB 相似的作用。總之，我們建議 4-AAQB 可作為對抗 μXg 誘導的破骨細胞形成的潛在藥物。 ijms-21-06971-g001.jpg" alt="圖1" />

圖1

4-AAQB 對RAW264.7 的影響...

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4-AAQB 對 RAW264.7 細胞活力的影響。 4-AAQB 的化學結構 ( A…

圖 1 4-AAQB 對 RAW264.7 細胞活力的影響。4-AAQB 的化學結構 (A)以v-Xg 或µXg 刺激細胞24 小時後，以alamarBlue 測定細胞活力(B)。 -g002a.jpg" alt="圖2" />

圖2

4-AAQB 破骨細胞形成減弱…

圖2

v-Xg 和µXg 刺激後4-AAQB 破骨細胞形成減弱。暴露於…

圖 2 v-Xg 和 µXg 刺激後，4-AAQB 破骨細胞形成減弱。在 v-Xg (A) 或 µXg (B) 中暴露 24 小時後，以 4-AAQB（0.1、1、3 或 10 µM) 或ALN (10 µM) 與RANKL 結合72 小時。 TRAP(+)破骨細胞數/孔(C)和TRAP(+)破骨細胞面積(%)(D)的定量結果代表平均值±SEM （n = 6）。此外，螢光染色（肌動蛋白環和DAPI；(E，F)）和定量結果（肌動蛋白環/孔數；(G< /b>） >)) 進行了。破骨細胞或肌動蛋白環以紅色箭頭表示。橙色矩形代表放大 200 倍的區域。 *** p < 0.001 與對照組相比； # p < 0.05，##p＜ 0.01，且 ### p < 0.001 與 RANKL 比較； ++ p < 0.01且+++p＜0.01 0.001 對比 v-Xg。

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< p> 4-AAQB 破骨細胞形成減弱…

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v-Xg 和µXg 刺激後4-AAQB 破骨細胞形成減弱。暴露於…

圖 2 v-Xg 和 µXg 刺激後，4-AAQB 破骨細胞形成減弱。在 v-Xg (A) 或 µXg (B) 中暴露 24 小時後，以 4-AAQB（0.1、1、3 或 10 µM) 或ALN (10 µM) 與RANKL 結合72 小時。 TRAP(+)破骨細胞數/孔(C)和TRAP(+)破骨細胞面積(%)(D)的定量結果代表平均值±SEM （n = 6）。此外，螢光染色（肌動蛋白環和DAPI；(E，F)）和定量結果（肌動蛋白環/孔數；(G< /b>） >)) 進行了。破骨細胞或肌動蛋白環以紅色箭頭表示。橙色矩形代表放大 200 倍的區域。 *** p < 0.001 與對照組相比； # p < 0.05，##p＜ 0.01，且 ### p < 0.001 與 RANKL 比較； ++ p < 0.01且+++p＜0.01 0.001 對比 v-Xg。

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v-Xg 和µXg 刺激後4-AAQB 破骨細胞形成減弱。暴露於…

圖 2 v-Xg 和 µXg 刺激後，4-AAQB 破骨細胞形成減弱。在 v-Xg (A) 或 µXg (B) 中暴露 24 小時後，以 4-AAQB（0.1、1、3 或 10 µM) 或ALN (10 µM) 與RANKL 結合72 小時。 TRAP(+)破骨細胞數/孔(C)和TRAP(+)破骨細胞面積(%)(D)的定量結果代表平均值±SEM （n = 6）。此外，螢光染色（肌動蛋白環和DAPI；(E，F)）和定量結果（肌動蛋白環/孔數；(G< /b>） >)) 進行了。破骨細胞或肌動蛋白環以紅色箭頭表示。橙色矩形代表放大 200 倍的區域。 *** p < 0.001 與對照組相比； # p < 0.05，##p＜ 0.01，且 ### p < 0.001 與 RANKL 比較； ++ p < 0.01且+++p＜0.01 0.001 對比 v-Xg。

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< p> 4-AAQB 破骨細胞吸收能力減弱…

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v-Xg 和µXg 刺激後4-AAQB 破骨細胞吸收能力減弱。暴露後…

圖3 v-Xg 和μXg 刺激後4-AAQB 破骨細胞吸收能力的衰減。在 v-Xg (A) 或 µXg (B) 中暴露 24 小時後，將細胞培養在骨測定 96 孔板中並用 4-AAQB 處理（0.1、 1、3 或10 µM）或ALN (10 µM) 與RANKL 組合120 小時。骨吸收面積(%)(C)定量結果代表平均值±SEM(n = 4)。白色箭頭表示吸收坑。 *** p < 0.001 與對照組相比； # p < 0.05，##p＜ 0.01，且 ### p < 0.001 與 RANKL 比較； ++ p < 0.01 對比 v-Xg。

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< p> 4-AAQB 對…的影響

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4-AAQB 對破骨細胞生成訊號路徑的影響。破骨細胞生成蛋白透過…

圖4 4-AAQB 對破骨細胞生成訊號路徑的影響。暴露於 v-Xg (A) 條件 24 小時後，以蛋白質印跡法測定破骨細胞生成蛋白。將細胞以 4-AAQB（1、3 或 10 µM）或 ALN（10 µM）與 RANKL 結合處理 54 小時。 NFATc1 (B)、c-Fos (C) 和 DC-STAMP (D) 的量化結果表示平均值±SEM (n = 3)。此外，在μXg（E）條件下暴露24小時後，將細胞在與v-Xg組相同的刺激條件下處理48小時。量化結果 (F–H) 代表平均值 ± SEM (n = 3)。 * p < 0.05，**p＜0.05 0.01且***p＜0.01 0.001 與對照組相比； # p < 0.05，##p＜ 0.01，且 ### p < 0.001 與 RANKL 相比。

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< p> 4-AAQB 對…的影響

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4-AAQB 對破骨細胞生成訊號路徑的影響。破骨細胞生成蛋白透過…

圖4 4-AAQB 對破骨細胞生成訊號路徑的影響。暴露於 v-Xg (A) 條件 24 小時後，以蛋白質印跡法測定破骨細胞生成蛋白。將細胞以 4-AAQB（1、3 或 10 µM）或 ALN（10 µM）與 RANKL 結合處理 54 小時。 NFATc1 (B)、c-Fos (C) 和 DC-STAMP (D) 的量化結果表示平均值±SEM (n = 3)。此外，在μXg（E）條件下暴露24小時後，將細胞在與v-Xg組相同的刺激條件下處理48小時。量化結果 (F–H) 代表平均值 ± SEM (n = 3)。 * p < 0.05，**p＜0.05 0.01且***p＜0.01 0.001 與對照組相比； # p < 0.05，##p＜ 0.01，且 ### p < 0.001 與 RANKL 相比。

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< p> 4-AAQB 對破骨細胞的影響…

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4-AAQB 對μXg 刺激後破骨細胞凋亡和細胞週期的影響…

圖5 影響4-AAQB 對 μXg 刺激後破骨細胞凋亡及細胞週期的影響。暴露於μXg（A）條件24小時後，以4-AAQB或ALN合併RANKL處理細胞48小時。以蛋白質印跡法測定凋亡蛋白。 cleaved PARP (B)、cleaved caspase-8 (C)、cleaved caspase-9 (D) 和 cleaved caspase 的量化結果-3 (E) 代表平均值±SEM (n = 3)。此外，也透過蛋白質印跡（F）檢測細胞週期蛋白。 p53 (G)、p21 (H)、cyclin D3 (I) 和 cyclin E1 (J< /b>) 代表平均值± SEM (n = 3)。 * p < 0.05，**p＜0.05 0.01，且***p＜0.01 0.001 與對照組相比； # p < 0.05，##p＜ 0.01，且 ### p < 0.001 與 RANKL 相比。

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4-AAQB 對μXg 刺激後破骨細胞凋亡和細胞週期的影響…

圖5 影響4-AAQB 對 μXg 刺激後破骨細胞凋亡及細胞週期的影響。暴露於μXg（A）條件24小時後，以4-AAQB或ALN合併RANKL處理細胞48小時。以蛋白質印跡法測定凋亡蛋白。 cleaved PARP (B)、cleaved caspase-8 (C)、cleaved caspase-9 (D) 和 cleaved caspase 的量化結果-3 (E) 代表平均值±SEM (n = 3)。此外，也透過蛋白質印跡（F）檢測細胞週期蛋白。 p53 (G)、p21 (H)、cyclin D3 (I) 和 cyclin E1 (J< /b>) 代表平均值± SEM (n = 3)。 * p < 0.05，**p＜0.05 0.01，且***p＜0.01 0.001 與對照組相比； # p < 0.05，##p＜ 0.01，且 ### p < 0.001 與 RANKL 相比。

圖6

< p> 自噬抑制劑對破骨細胞的減弱…

圖6

µXg 刺激後自噬抑制劑對破骨細胞形成的減弱。檢測自噬蛋白...

圖 6 µXg 刺激後自噬抑制劑減弱破骨細胞形成。 Western blotting (A)可偵測自噬蛋白。 b>)、Atg 7 (D) 和Atg 5 (E) 代表平均值± SEM (n = 3)。 µXg 條件下細胞刺激 24 小時後，以 alamarBlue 檢測細胞活力 2 小時； 3-MA (F) 或 CQ (G) 刺激持續 72 小時。定量結果代表平均值±SEM (n = 3)。在μXg（H）條件下刺激細胞24小時後進行TRAP染色。細胞以 4-AAQB (10 µM)、3-MA (1 mM) 或 CQ (10 µM) 結合 RANKL 處理 72 小時。 TRAP(+)破骨細胞數/孔(I)和TRAP(+)破骨細胞面積(%)(J)的定量結果代表平均值±SEM （n = 6）。 µXg（K）條件刺激24 h後進行螢光染色，並以4-AAQB、3-MA或CQ合併RANKL處理細胞72 h。肌動蛋白環數/孔(L)的定量結果代表平均值±SEM(n = 4)。暴露於μXg（M）條件24小時後，以4-AAQB、3-MA或CQ合併RANKL處理細胞48小時。以蛋白質印跡法測定破骨細胞生成蛋白。 NFATc1 (N)、c-Fos (O) 和 DC-STAMP (P) 的量化結果代表平均值±SEM（ n = 3）。破骨細胞或肌動蛋白環以紅色箭頭表示。橙色矩形代表放大 200 倍的區域。 * p < 0.05，**p＜0.05 0.01，且***p＜0.01 0.001 與對照組相比； # p < 0.05，##p＜ 0.01，且 ### p < 0.001 與 RANKL 相比。

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< p> 自噬抑制劑對破骨細胞的減弱…

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µXg 刺激後自噬抑制劑對破骨細胞形成的減弱。檢測自噬蛋白...

圖 6 µXg 刺激後自噬抑制劑減弱破骨細胞形成。 Western blotting (A)可偵測自噬蛋白。 b>)、Atg 7 (D) 和Atg 5 (E) 代表平均值± SEM (n = 3)。 µXg 條件下細胞刺激 24 小時後，以 alamarBlue 檢測細胞活力 2 小時； 3-MA (F) 或 CQ (G) 刺激持續 72 小時。定量結果代表平均值±SEM (n = 3)。在μXg（H）條件下刺激細胞24小時後進行TRAP染色。細胞以 4-AAQB (10 µM)、3-MA (1 mM) 或 CQ (10 µM) 結合 RANKL 處理 72 小時。 TRAP(+)破骨細胞數/孔(I)和TRAP(+)破骨細胞面積(%)(J)的定量結果代表平均值±SEM （n = 6）。 µXg（K）條件刺激24 h後進行螢光染色，並以4-AAQB、3-MA或CQ合併RANKL處理細胞72 h。肌動蛋白環/孔數（L）的定量結果代表平均值±SEM（n = 4）。暴露於μXg（M）條件24小時後，以4-AAQB、3-MA或CQ合併RANKL處理細胞48小時。以蛋白質印跡法測定破骨細胞生成蛋白。 NFATc1 (N)、c-Fos (O) 和 DC-STAMP (P) 的量化結果代表平均值±SEM（ n = 3）。破骨細胞或肌動蛋白環以紅色箭頭表示。橙色矩形代表放大 200 倍的區域。 * p < 0.05，**p＜0.05 0.01，且***p＜0.01 0.001 與對照組相比； # p < 0.05，##p＜ 0.01，且 ### p < 0.001 與 RANKL 相比。

圖7

< p> 4-AAQB 在...中的建議機制

圖7

4-AAQB 在破骨細胞生成中的建議機制。

圖7 4-AAQB 在破骨細胞生成中的建議機制。 所有人物 (12)