Antrodin C 透過抑制 Smad2/3 和 β-catenin 訊息傳遞路徑抑制乳癌細胞的上皮間質轉化和轉移
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圖 1. 化學結構Antrodin C…
圖1.Antrodin C (ADC) 的化學結構。
同義詞：3-異丁基-4-[4-(甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1 H-吡咯-2,5-二酮；分子式：C…
圖1. Antrodin C (ADC) 的化學結構。 別名：3-異丁基-4-[4-(甲基-2-丁烯氧基)苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮；分子式：C19H23NO4；分子量：329.39。
圖 2. ADC 對 MCF 的影響- 7…
圖2. ADC 對MCF-7 細胞活力的影響。
( A ) MCF-7 細胞是…
圖 2. ADC 對 MCF-7 細胞活力的影響。 (A) MCF-7 細胞與濃度不斷增加的 ADC (5–40 μM) 一起孵育 48 小時。 (B) 細胞以 ADC (5–20 μM) 預處理 2 小時，然後與 TGF-β1 孵育 48 小時。以MTT比色法測定細胞活力。細胞活力的百分比是透過對照細胞(0.1％DMSO)的吸收作為100％來計算。數據報告為三個獨立實驗的平均值±SD。 θP＜ 0.001，與對照組及TGF-β1治療組有顯著差異。 *P＜與單獨 TGF-β 治療組和 ADC 治療組相比有 0.05 顯著差異。
圖3. ADC 阻斷TGF-β1 -誘導 EMT…
圖 3. ADC 阻斷乳癌細胞中 TGF-β1 誘導的 EMT。
MCF-7 細胞用…進行預處理
圖 3. ADC 阻斷乳癌細胞中 TGF-β1 誘導的 EMT。 MCF-7 細胞先用 ADC (5–20 μM) 預處理 2 小時，然後用 TGF-β1 (20 ng/mL) 刺激 48 小時。 (A) 以相差顯微鏡檢查形態變化尤其是細胞散射。這裡顯示的顯微照片來自三個獨立實驗之一。 (B) ADC 抑制 MCF-7 細胞中 TGF-β1 誘導的肌動蛋白細胞骨架重組。將 ADC 和 TGF-β1 處理的細胞固定、通透並用 FITC-鬼筆環肽染色，以可視化 F-肌動蛋白細胞骨架重組。這些圖像代表三個獨立實驗。條形，20 μm。 (C) 從對照、ADC 和TGF-β 處理的細胞中分離蛋白質樣品，用於檢測E-鈣黏蛋白、閉塞蛋白、波形蛋白、N-鈣黏蛋白和β-肌動蛋白。 β-肌動蛋白作為內部對照。所提供的蛋白質印跡數據代表了至少三個獨立實驗中獲得的數據。
圖 4. ADC 抑制 TGF-β1-誘導轉錄活性...
圖4. ADC 抑制TGF-β1 誘導的Smad2/Smad3 轉錄活性。
( A ) MCF-7 細胞是…
圖 4. ADC 抑制 TGF-β1 誘導的 Smad2/Smad3 轉錄活性。 (A) MCF-7 細胞先以 ADC (5–20 μM) 預處理 2 小時，然後以 TGF-β1 (20 ng/mL) 刺激 24 小時。使用特異性抗體進行蛋白質印跡分析以檢查 Snail、Slug 和 TWIST 的蛋白質表現量。 β-肌動蛋白作為內部上樣對照。 (B) 細胞以 pGL3-SBE-4-Luc 報告構建體轉染，然後用 ADC (5–20 μM) 預處理，然後用 TGF-β1 刺激 3 小時。螢光素酶活性以與未處理細胞的螢光素酶活性相比的相對值表示（設定為1倍）。 (C) 進行蛋白質印跡來測量 Smad2 和 Smad3 蛋白的總水平和磷酸化水平。 (D) 以共聚焦顯微鏡免疫螢光分析檢測TGF-β1誘導的磷酸化Smad2和Smad3的核轉位。細胞以ADC (20 μM)預處理2小時，然後與TGF-β1孵育1小時。處理後，將細胞固定、透化，並與 Phos-Smad2 或 Phos-Smad3 一抗孵育過夜，然後分別與 FITC 和 TRITC 二抗孵育 1 小時。細胞 DNA 以 DAPI (1 μg/mL) 染色，並透過共焦顯微鏡（放大倍率 200）捕捉影像。條形，20 μm。數據報告為三個獨立實驗的平均值±SD。 θP＜ 0.001，與對照組及TGF-β1單獨治療組有顯著差異。 *P＜ 0.05，**P＜0.05 0.01，且***P＜0.01 0.001 與單獨使用 TGF-β1 和 ADC 治療組有顯著差異。
圖 5. ADC 抑制 TGF-β1-誘導乳癌...
圖5. ADC 抑制TGF-β1 誘導的乳癌細胞遷移和侵襲。
(A) 細胞遷移是…
圖5. ADC 抑制TGF-β1 誘導的乳癌細胞遷移和侵襲。 (A) 以傷口癒合實驗測定細胞遷移，以 ADC (5-20 μM) 預處理匯合的 MCF-7 單層細胞 2 h，以 200 μL 移液器吸頭刮傷細胞，洗滌去除碎片，然後添加含有1% FBS 和TGF-β1 (20 ng/mL) 的新鮮培養基。然後將細胞孵育48小時。使用倒置顯微鏡在 0 小時和 48 小時拍攝照片，放大倍率為 10 倍。透過測量直方圖所示的傷口閉合面積來確定 TGF-β1 誘導的細胞運動。將相同樣品中 48 小時時的閉合面積與 0 小時時的閉合面積進行比較。 (B) 對於侵襲測定，將預處理的細胞接種到含有 1% FBS 的 DMEM 的 24 孔 Transwell 室的上室中。下室充滿完全血清培養基。讓細胞侵襲48小時。然後固定入侵細胞，用吉姆薩染色液染色並在5個隨機視野中計數。以直方圖呈現各組的平均侵襲細胞。數據報告為三個獨立實驗的平均值±SD。 θP＜ 0.001，與對照組及TGF-β1單獨治療組有顯著差異。 *P＜ 0.05，**P＜0.05 0.01，且***P＜0.01 0.001 與單獨使用 TGF-β1 和 ADC 治療組有顯著差異。
圖 6. ADC 下調 TGF- β1 誘導的MMP 活性…
圖6. ADC 下調乳癌細胞中TGF-β1 誘導的MMP 活性。
( A ) MCF-7…
圖 6. ADC 下調乳癌細胞中 TGF-β1 誘導的 MMP 活性。 (A) MCF-7 細胞以 ADC (5–20 μM) 預處理 2 小時，然後以 TGF-β1 (20 ng/mL) 刺激 48 小時。使用從 MCF-7 細胞收集的條件培養基進行明膠酶譜分析。 (B) 使用特異性抗體以蛋白質印跡分析測定 MT1-MMP、MMP-2、MMP-9 和 uPA 的蛋白質表現量。看家蛋白 β-肌動蛋白作為內部上樣對照。箭頭表示 MMP-2 的原形式和裂解形式。數據報告為三個獨立實驗的平均值±SD。 θP＜ 0.001，與對照組及TGF-β1單獨治療組有顯著差異。 *P＜ 0.05，**P＜0.05 0.01，且***P＜0.01 0.001 與單獨使用 TGF-β1 和 ADC 治療組有顯著差異。
圖 7.ADC 抑制 TGF-β1-誘導轉錄活化…
圖7. ADC 抑制TGF-β1 誘導的β-連環蛋白乳癌細胞轉錄活化。
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圖 7. ADC 抑制 TGF-β1 誘導的 β-catenin 乳癌細胞轉錄活化。 (A) MCF-7 細胞與帶有螢光素酶報告基因構建體的 TOP-flash 或 FOP-flash 或 pCMV-β-Gal 共轉染。轉染後，細胞以 ADC (5–20 μM) 預處理 2 小時，然後以 TGF-β1 刺激 3 小時。測定螢光素酶活性並以 β-gal 活性標準化。直方圖顯示相對螢光素酶活性（倍數增加）。 (B) 細胞以 ADC (5–20 μM) 預處理 2 小時，然後以 TGF-β1 刺激 2 小時。使用特定的細胞質和細胞核萃取物以蛋白質印跡分析測定細胞質和細胞核中的β-連環蛋白表現。 β-肌動蛋白和組蛋白分別作為胞漿和核部分的內部對照。 (C) 以免疫螢光染色測定MCF-7細胞中β-catenin的核定位。 MCF-7 細胞接種於 8 孔 Tek 室中並黏附 24 小時。 ADC (5–20 μM) 2 小時，然後以 TGF-β1 刺激 2 小時。處理後，將細胞固定、透化，並以 β-catenin 一抗孵育過夜，然後用 FITC 二抗孵育 1 小時。細胞 DNA 以 DAPI (1 μg/mL) 染色，並透過共焦顯微鏡（放大倍率 200）捕捉影像。 (D) 將細胞與 ADC (5–20 μM) 預孵育 2 小時，然後以 TGF-β1 刺激 1 小時。以蛋白質印跡分析測定β-連環蛋白和GSK3β的磷酸化和總蛋白表現量。數據報告為三個獨立實驗的平均值±SD。 θP＜ 0.001，與對照組和 TOP-Flash 轉染組中單獨的 TGF-β1 治療組有顯著差異。 *P＜ 0.05，**P＜0.05 0.01，且***P＜0.01 TOP-Flash 轉染組中 0.001 與單獨使用 TGF-β1 和 ADC 治療組有顯著差異。
圖 8.示意圖表示反轉移…< /p>
圖8。
TGF-β 配體與 TGF-β 結合...
圖 8。 TGF-β 配體與TGF-β 受體II (TGF-βRII) 結合，將TGF-βRI 招募到四聚體受體複合物中，導致TGF-βRI 轉磷酸化和激活，然後磷酸化Smad2 或Smad3 。磷酸化的 Smad2/3 與 Smad4 結合併移位到細胞核中，在細胞核中活化包括 snail、slug 和 Twist 在內的目標基因的轉錄。這些基因透過抑制上皮標記物和誘導間質標記物來調節 EMT。 ADC 預處理透過抑制 Smad2/3 的磷酸化和轉錄活化來抑制 TGF-β 誘導的 EMT。此外，TGF-β 透過抑制 GSK3β（β-連環蛋白的負調節因子）來活化 β-連環蛋白訊號級聯。遊離形式的 β-連環蛋白易位到細胞核並轉錄許多遷移標記基因，包括 MMP-2、MMP-9 和 uPA。 ADC 預處理透過抑制 β-catenin 轉錄活化以及下調 MMP-2、MMP-9 和 uPA 來阻斷 TGF-β1 誘導的 MCF-7 細胞遷移和侵襲。此外，先前的報導表明，MMPs的表達也受蝸牛、轉錄因子調控EMT的調節。 snail 表現的減少可能會影響 MMP 的活性。此外，據報導，Twist 是 β-catenin 的下游靶點之一。因此，我們認為ADC誘導的β-catenin下調與Twist之間可能存在串擾。 所有人物 (8)