antrodin C 活化 Nrf2 介導的抗氧化基因可預防高血糖誘導的人類內皮細胞老化和凋亡

摘要

在本研究中，我們研究了 antrodin C (ADC)（一種從牛樟芝菌絲體中分離出來的馬來酰亞胺衍生物）對高葡萄糖（HG，30 mM）加速內皮功能障礙體外。 ADC 顯著改善了 HG 誘導的人類臍靜脈內皮細胞 (HUVEC) 細胞毒性。此外，ADC 治療可顯著預防 HG 誘導的 HUVEC 老化、G1-S 過渡期生長停滯和細胞凋亡。此外，ADC 顯著改善了 HG 條件下細胞內活性氧 (ROS) 水平的升高。進一步分析表明，ADC 介導的抗氧化作用是由於細胞抗氧化基因 HO-1 和 NQO-1 通過促進 Nrf2 的轉錄活性而上調，從而上調 Nrf2 的轉錄活性。 ADC 未能保護HUVEC 免於HG 誘導的功能障礙，進一步證實了這一點。此外，ADC 可顯著預防高滲透壓葡萄糖(HOG，60 mM) 誘導的不受控制的ROS 產生、快速凋亡細胞死亡和HUVEC 損傷，而在HO-1 抑製或Nrf2 沉默的細胞中幾乎觀察不到這些預防作用。綜上所述，這些結果表明 ADC 可能透過活化 Nrf2 依賴性細胞抗氧化防禦系統來幹預糖尿病相關心血管疾病。 /upload/2024/12/oncotarget-08-96568-g001.jpg" alt="圖1" />

圖1. HG 和…的細胞毒性作用

< p> 圖1. HG 和ADC 對HUVEC 的細胞毒性作用

A. Antrodin 的化學結構… 圖1. HG 和ADC 對HUVEC 的細胞毒性作用A. > Antrodin C (ADC) 的化學結構。 B. HUVEC 與濃度逐漸增加的 ADC 一起孵育 24-72 小時，並透過 MTT 測定測量細胞活力。將細胞活力百分比與對照組（0.01% DMSO）進行比較。 C. HUVEC與不同劑量的HG一起孵育24-72小時，並透過MTT測定測量細胞活力。將細胞活力百分比與 NG 治療組進行比較。 D. 在有或沒有 ADC 或 RES 的情況下，將細胞與 HG 一起孵育 72 小時。將細胞活力百分比與 NG 治療組進行比較。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。統計顯著性設定為ФP＜0。與 NG 相比 HG 為 0.05，*P＜0.05與 HG 和樣品相比為 0.05。

圖2. ADC的保護效果on…

圖2. ADC 對HG 誘導的HUVEC 凋亡和生長停滯的保護作用

A. HUVEC… 圖2. ADC 對HG- 的保護作用誘導 HUVEC 凋亡和生長停滯 A。以膜聯蛋白 V/PI 染色進行細胞凋亡，並以流式細胞儀測定亞二倍體 DNA。 B. 在有或沒有 ADC 或 RES 的情況下用 HG 處理 HUVEC 72 小時。如材料與方法所述，透過LDH測定試劑盒測量HUVEC培養物上清液中的LDH釋放量。 C.-E. 以蛋白質印跡分析測定細胞色素 C、caspase-9 和 caspase-3 的蛋白質表現量。細胞色素 C 的相對蛋白質表現以 β-actin 標準化，而 cleaved capase-9 和 cleaved caspase-3 水準分別以 pro-caspase-9 和 pro-caspase-3 標準化。 F. 以流式細胞儀測定HUVECs增殖指數。 G. HUVEC 在 ADC 或 RES 存在下與 HG 一起孵育 72 小時。使用 PI 透過流式細胞儀測量細胞週期分佈。每個過渡階段的細胞群百分比顯示在直方圖中。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。統計顯著性設定為ФP＜0。與 NG 相比 HG 為 0.05，*P＜0.05與 HG 和樣品相比為 0.05。

圖 3. ADC 防止 HG-誘導老化...

圖3. ADC 預防HUVEC 中HG 誘導的衰老

決定ADC 對... 的影響

圖3. ADC 預防HG 誘導的老化為了確定 ADC 對 HG 誘導的衰老的影響，在有或沒有 ADC 或 RES 的情況下，將 HUVEC 與 HG 一起孵育 72 小時。 A.以SA-β-gal測定來測定細胞老化。上圖顯示代表性數據，下圖顯示每個顯微鏡視野中 SA-β-gal 陽性細胞的定量分析。 B.,E.,F. 使用特異性一抗和FITC-以免疫螢光法測量SMP30、p21CIP1 和乙醯化p53 的蛋白表達偶聯二抗（綠色）。使用螢光顯微鏡拍攝 SMP30、p21CIP1 和乙醯化 p53 的細胞定位。 DAPI 用於對細胞核進行染色。 C. 以蛋白質印跡分析測定SMP30蛋白表現水平，並以GAPDH標準化相對SMP30表現。 D. 以蛋白質印跡法測定老化相關蛋白 p21CIP1 和 p16INK4A 水平，並以 GAPDH 標準化相對蛋白水平。 G.,H. 以蛋白質印跡分析測量乙醯化 p53、磷酸化 p53 和磷酸化 Rb 的蛋白質量。 ac-p53和p-Rb的相對蛋白質量分別以總p53和總Rb量標準化。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。統計顯著性設定為ФP＜0。與 NG 相比 HG 為 0.05，*P＜0.05與 HG 和樣品相比為 0.05。

圖 4. ADC 啟動 Nrf2-依賴的抗氧化防禦…

圖4. ADC 活化HUVEC 中Nrf2 依賴的抗氧化防禦

A. 確定ROS 抑制… 圖4. ADC活化HUVEC 中Nrf2 依賴性抗氧化防禦A。孵育後，使用 DCFH2-DA 螢光探針以光譜儀測量細胞內 ROS。 B. 以DPPH法測定ADC的自由基清除活性。 NAC和RES用作陽性對照。 C.，F. 在有或沒有 ADC 或 RES 的情況下用 HG 處理細胞 24 小時。以蛋白質印跡分析測定 HO-1、NQO-1、Nrf2 和 Keap-1 的蛋白質量。 D. 為了定量 HO-1 和 NQO-1 的 mRNA 表現水平，在有或沒有 ADC 或 RES 的情況下，將 HUVEC 與 HG 一起孵育 24 小時。總RNA進行Q-PCR分析。相對 mRNA 水平以 β-肌動蛋白 mRNA 標準化。 E. HUVEC 以 ZnPP (10 mM) 預處理 2 小時，然後在有或沒有 ADC 或 RES 的情況下與 HG 一起孵育 24 小時。透過分光光度計對細胞內 ROS 進行定量。 G. 透過免疫螢光分析確定Nrf2的蛋白質表現和核定位。使用螢光顯微鏡拍攝 Nrf2 的亞細胞和核定位。 DAPI 用於對細胞核進行染色。 H. 為了確定 Nrf2 轉錄活性，使用 ipofectamine 以 ARE 啟動子構建體瞬時轉染 HUVEC，並在有或沒有 ADC 或 RES 的情況下與 HG 一起孵育 6 小時。將細胞裂解物與螢光素酶試劑混合後使用照度計進行定量。相對 ARE 啟動子活性的倍數變化與未處理的細胞 (NG) 進行比較。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。統計顯著性設定為ФP＜0。與 NG 對比 HG 相比，*P < 0.05與 HG 相比，樣品為 0.05，且 θP ＜ 0.05與 HG 與 ZnPP 預處理組相比為 0.05。

圖 5. ADC 具有保護功能效果...

圖5. ADC 對Nrf2 沉默細胞具有保護作用

HUVECs 轉染...

圖5. ADC 對Nrf2 沉默細胞HUVEC 有保護作用以針對 Nrf2 的特異性 siRNA 或亂序 siRNA 轉染。轉染24小時後，在有或沒有ADC或RES的情況下將細胞與HG一起孵育24-72小時。 A. 使用螢光分光光度計以 DCFH2-DA 測定法測量細胞內 ROS。萃取總RNA並進行Q-PCR分析以確定HO-1和NQO-1 mRNA表現量。 B. 孵育72 h後，以SA-β-gal檢測試劑盒測定SA-β-gal活性。左圖顯示代表性圖，右圖顯示每個顯微鏡視野的 SA-β-gal 陽性細胞的定量分析。 C. 以MTT比色法測定細胞活力。 D. 流式細胞儀測定細胞增殖指數。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。統計顯著性設定為ФP＜0。與 NG 對比 HG 相比，*P < 0.05與 HG 相比，樣品為 0.05，且 θP ＜ 0.05與 HG 與 siNrf2 轉染組相比為 0.05。

圖 6. ADC 保護 HUVEC高滲…

圖6. ADC 保護HUVEC 免受高滲透壓葡萄糖(HOG) 誘導的細胞死亡

HUVEC 與…一起孵育

圖6. ADC 保護HUVEC 免受高滲透壓葡萄糖的影響(HOG) 誘導的細胞死亡 HUVEC 在有或沒有 ADC 或 RES 的情況下與 HOG 一起孵育 24 小時。 A. 以MTT比色法測定細胞活力。 B. HUVEC 損傷透過 LDH 釋放到培養基中來確定。 C. 以 DCFH2-DA 螢光測定法對細胞內 ROS 產生進行定量。 D. 以膜聯蛋白 V/PI 染色法測定細胞凋亡。 E.,F. 以蛋白質印跡分析測量 Bax 蛋白質水平和細胞色素 C 水平。 Bax 和細胞色素 C 的相對蛋白質量以 β-肌動蛋白標準化。 G.,H. 以蛋白質印跡分析測定 caspase-9、caspase-3 和 PARP 的活化（裂解形式），並將蛋白質水平與其相應的標準化親形式。 I. HUVEC 與 caspase-3 抑制劑（Z-VAD-FMK，30 µM）預孵育 2 小時，然後在有或沒有 ADC 或 RES 的情況下與 HG 孵育 24 小時。透過MTT測定測定細胞活力。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。統計顯著性設定為ФP＜0。與 NG 相比 HG 為 0.05，*P＜0.05與 HG 和樣品相比為 0.05。

圖 7. ADC 保護失敗HOG誘導的…

圖7. Nrf2 沉默條件下ADC 未能保護HOG 誘導的HUVEC 凋亡

A. HUVEC… 圖7. ADC 未能保護HOG -在Nrf2沉默條件下誘導HUVEC細胞凋亡A。轉染24小時後，在有或沒有ADC或RES的情況下將細胞與HOG一起孵育24小時。使用流式細胞儀以膜聯蛋白 V/PI 染色測定 HUVEC 細胞凋亡。 B. HUVEC 用 ZnPP 預處理 2 小時，然後在有或沒有 ADC 或 RES 的情況下與 HOG 一起孵育 24 小時。以流式細胞儀定量凋亡細胞死亡。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。統計顯著性設定為ФP＜0。與 NG 對比 HG 相比，*P < 0.05與 HG 相比，樣品為 0.05，且 θP ＜ 0.05 siNrf2 轉染細胞中 NG 與 HOG 相比為 0.05。

圖 8. antrodin 示意圖C 介導的…

圖8. antrodin C 介導的針對高葡萄糖或高滲葡萄糖誘導的衰老的保護作用的示意圖…

圖8. antrodin C 介導的針對高葡萄糖的保護作用的示意圖或高滲透壓葡萄糖誘導人類內皮細胞衰老和凋亡高葡萄糖誘導細胞內ROS，從而觸發p53乙醯化。活化的p53上調p16INK4A和p21CIP1，進一步活化Rb，使細胞週期在G1-S轉變時停滯並誘導細胞老化。相反，高滲透壓葡萄糖會誘導細胞ROS產生異常，最終誘導HUVEC細胞凋亡。然而，antrodin C 處理會活化 Nrf2 依賴性抗氧化基因，例如 HO-1 和 NQO-1，隨後降解 Keap-1，從而促進 ROS 抑制及其下游級聯反應，包括細胞週期停滯、老化和凋亡在人類內皮細胞中。 所有人物 (8)