Antrocin 透過抑制 PI3K/AKT 和 MAPK 訊息傳遞路徑使前列腺癌細胞對放射治療敏感
摘要
放射治療是局部或區域性晚期前列腺癌 (PCa) 最常見的治療選擇之一。重要的是，PCa容易產生放射抗性，並且在長期放射治療後往往會發展為惡性腫瘤。 Antrocin 是一種從牛樟芝中分離出來的倍半萜內酯，具有對抗多種癌症的藥理功效；然而，其治療潛力需要全面探索，特別是在抗輻射 PCa 細胞中。在本研究中，我們強調了 antrocin 對放射抗性 PCa 細胞的影響，並探討了 antrocin 誘導放射增敏的分子機制。我們的結果表明，antrocin 和電離輻射 (IR) 聯合治療可協同抑制放射抗性 PCa 細胞的細胞增殖並誘導細胞凋亡。我們進一步證明，antrocin 下調 PI3K/AKT 和 MAPK 訊號通路，並抑制 1 型胰島素樣生長因子 1 受體 (IGF-1R) 介導的 β-catenin 誘導，從而調節細胞週期和細胞凋亡。使用異種移植小鼠模型，我們表明安曲星有效增強前列腺癌的放射治療。我們的研究表明，antrocin 透過對IGF-1R 下游訊號傳導的組成性抑制使PCa 對輻射敏感，這表明它可以開發為克服放射抗性PCa 的有效治療劑。圖
圖1
Antrocin 抑制PCa 細胞增生...
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Antrocin 抑制PCa 細胞增生並使PCa 細胞對IR 誘導的細胞死亡敏感。 > 圖1 Antrocin 抑制PCa 細胞增生並致敏PCa 細胞受到 IR 誘導的細胞死亡。 (A) PC3-Con、PC3-KD、LAPC4-Con 和 LAPC4-KD 細胞以不同濃度的 antrocin (0、1、5、10、20、50、100、200和500 μM ）48 小時。在100μM antrocin濃度下獲得了對細胞活力的大約一半最大抑制。 (B) PC3-KD 細胞暴露於 IR (0–6 Gy) 和 antrocin（分別為 50、100 或 200 μM），然後孵育 48 小時。透過使用MTT測定評估細胞增殖。 (C) PC3-KD 細胞單獨以 IR (0–6 Gy) 處理或合併處理 IR 和 antrocin (100 μM)。孵育 7 天后，以結晶紫對存活細胞集落進行染色，並以方法部分所述的克隆形成測定進行評估 (D)。以雙向變異數分析評估統計顯著性(*p＜0.01)。 
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< p> Antrocin 和輻射協同阻滯…圖2
Antrocin 和輻射協同阻滯細胞週期在G2/M 並調節細胞凋亡相關…
圖2 Antrocin 和輻射協同地將細胞週期阻滯在 G2/M 期，並調節抗輻射 PCa 細胞中的凋亡相關分子。 (A) PC3-KD 細胞以載體對照、單獨的 IR (2 Gy)、單獨的 antrocin (100 μM) 或 IR 與 antrocin 組合處理，並孵育 48 小時。透過流式細胞儀分析基於 DNA 含量的細胞週期分佈。 (B) 不同的細胞階段被繪製為總事件的百分比。 (C,D) 收穫細胞裂解物並進行蛋白質印跡分析以確定蛋白質表現量。數據代表三個獨立實驗之一。 β-肌動蛋白作為加載對照。
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< p> PCa 中的基因表現譜...圖3
用IR 和antrocin 處理的PCa 細胞中的基因表現譜。 PC3-KD 後…
圖 3 經 IR 和 antrocin 處理的 PCa 細胞中的基因表現譜。 PC3-KD細胞以antrocin (100 μM)和/或IR (2 Gy)處理，或IR和antrocin共同處理後，進行微陣列分析。 (A) 熱圖分析顯示了基因表現的變化。顯示了凋亡相關基因的分析。 (B) 以 qRT-PCR 驗證了治療組和未治療組之間差異表達的凋亡相關基因。給出了平均倍數變化。以雙向變異數分析評估統計顯著性(*p＜0.01)。
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< p> 敲低ZNF443、TNFSF13B…圖4
敲低ZNF443、TNFSF13B、COL2A1 和TMX1 會降低antrocin 和…
圖4 敲低ZNF443、TNFX1 會降低antrocin 和… 圖4 敲低ZNF443、TNFNF13B、SF13B、SF COL2A1 和TMX1 降低antrocin 和IR 誘導的細胞凋亡相關分子的表達。 (A) 使用 qRT-PCR 分析 shRNA 對照 (shControl) 和 shRNA 敲低細胞中的 mRNA 量。 GAPDH 作為內部對照。 * p <與各組相比為 0.01。 (B) PC3-KD 細胞以 shControl 或基因標靶 shRNA 轉染。 shControl 或 shRNA 敲低細胞以載體處理或以 IR (2 Gy) 和 antrocin (100 μM) 共同處理 48 小時。收穫細胞裂解物並進行蛋白質印跡分析。數據代表三個獨立實驗之一。 β-肌動蛋白作為加載對照。
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< p> Antrocin 抑制PI3K/AKT 和...圖5
Antrocin 抑制PI3K/AKT 和MAPK 訊號路徑以及IGF-1R 的磷酸化。 PC3-KD…
圖5 Antrocin 抑制 PI3K/AKT 和 MAPK 訊息傳遞路徑以及 IGF-1R 的磷酸化。 PC3-KD 細胞以 IR (2 Gy)、antrocin (100 μM) 或 IR 加 antrocin 處理，然後孵育 48 小時。 (A) 透過獨創性路徑分析確定了所代表的基因網絡。每條線的顏色表示基因表現的調節。 (B) 收集細胞裂解物，並使用針對 p85、p110、p-AKT、AKT、GSK3-β、p-GSK3-β、p-β-連環蛋白和β-連環蛋白和(C) 抗IGF-1R、p38、JNK、Erk1/2 及其各自磷酸化形式的抗體。數據代表三個獨立實驗之一。 β-肌動蛋白作為加載對照。透過訊號強度對每種蛋白質的表達量進行定量，並用每個載體未處理組進行標準化。每種蛋白質表現的相對水平顯示在每條泳道的底部。
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Antrocin 抑制PI3K/AKT 和MAPK 訊號路徑以及IGF-1R 的磷酸化。 PC3-KD…
圖5 Antrocin 抑制 PI3K/AKT 和 MAPK 訊息傳遞路徑以及 IGF-1R 的磷酸化。 PC3-KD 細胞以 IR (2 Gy)、antrocin (100 μM) 或 IR 加 antrocin 處理，然後孵育 48 小時。 (A) 透過獨創性路徑分析確定了所代表的基因網絡。每條線的顏色表示基因表現的調節。 (B) 收集細胞裂解物，並使用針對 p85、p110、p-AKT、AKT、GSK3-β、p-GSK3-β、p-β-連環蛋白和β-連環蛋白和(C) 抗IGF-1R、p38、JNK、Erk1/2 及其各自磷酸化形式的抗體。數據代表三個獨立實驗之一。 β-肌動蛋白作為加載對照。透過訊號強度對每種蛋白質的表達量進行定量，並用每個載體未處理組進行標準化。每種蛋白質表現的相對水平顯示在每條泳道的底部。
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< p> Antrocin 協同增強輻射抑制的PCa…圖6
Antrocin 協同增強輻射抑制的PCa 在體內的生長。 ( A ) 小鼠...
圖 6 Antrocin 協同增強體內輻射抑制的 PCa 生長。 (A) 將患有異種移植腫瘤的小鼠分為四組：用媒介物治療、用IR (2 Gy) 治療、用antrocin (100 mg/kg) 治療或用IR 和IR 聯合治療。箭頭表示在小鼠後側生長的腫瘤。 (B) 在第 1、3、5、7、9、11 和 13 天進行治療。影像中顯示的比例以公分為單位。 (C) 記錄小鼠體重。 (D) 測量腫瘤體積，數據以平均值±SEM 表示。車輛與 IR：p = 0.0264；載體與 Antrocin：p = 0.0177；載體與 Antrocin+IR：p = 0.0116； IR 與 Antrocin：p = 0.0211； IR 與 Antrocin+IR 比較：p = 0.0192。以雙向變異數分析評估統計顯著性(*p＜0.01)。
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< p> 代表性免疫組織化學(IHC) 染色模式...圖7
異種移植PCa 組織中代表性免疫組織化學(IHC) 染色模式。石蠟的 IHC 分析...
圖 7 異種移植 PCa 組織中的代表性免疫組織化學 (IHC) 染色模式。石蠟切片的 IHC 分析顯示分別以針對 PARP、裂解半胱天冬酶 9、磷酸-AKT、磷酸-β-連環蛋白和細胞週期蛋白 D1 的特異性抗體進行染色。影像以 200 倍放大倍率拍攝。
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< p> 代表性免疫組織化學(IHC) 染色模式...圖7
異種移植PCa 組織中代表性免疫組織化學(IHC) 染色模式。石蠟的 IHC 分析...
圖 7 異種移植 PCa 組織中的代表性免疫組織化學 (IHC) 染色模式。石蠟切片的 IHC 分析顯示分別以針對 PARP、裂解半胱天冬酶 9、磷酸-AKT、磷酸-β-連環蛋白和細胞週期蛋白 D1 的特異性抗體進行染色。影像以 200 倍放大倍率拍攝。
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< p> 建議的作用機制...圖8
建議的安曲星誘導放射抗性PCa 細胞對放射治療敏感的作用機制。 > 圖8 所提出的作用機制Antrocin 誘導抗放射 PCa 細胞對放射治療敏感的作用。 IGF-1 與 IGF-1R 結合並誘導 IRS/Shc 磷酸化，從而活化 PI3K/AKT 和 MAPK 訊號傳導。以 antrocin 和放射線共同治療細胞可抑制 IGF1 誘導的 PI3K/AKT 和 MAPK 路徑激活，有效提高 PCa 細胞對放射治療的敏感性。 IRS：胰島素受體底物； Shc：src同源/膠原蛋白； LEF：淋巴增強因子； TCF：轉錄因子； Ub：泛素。 所有人物 (10)