Antcin K 抑制滑膜纖維母細胞中 TNF-α、IL-1β 和 IL-8 的表達並改善軟骨退化：對類風濕關節炎治療的影響

摘要

台灣傳統藥用蘑菇牛樟芝萃取物在細胞和臨床前研究中表現出抗發炎活性。然而，本文首次報導了從A.分離出的三萜類化合物Antcin K。 cinnamomea，抑制人類風濕滑膜成纖維細胞 (RASF) 中促炎細胞因子的產生，而 RASF 是類風濕性關節炎 (RA) 疾病的主要參與者。在我們對作用機制的分析中，Antcin K 會抑制人類 RASF 中三種細胞激素（腫瘤壞死因子 α [TNF-α]、白血球介素 1 β [IL-1β] 和 IL-8）的表達；對 RA 滑膜發炎至關重要的細胞激素。值得注意的是，RASF 與Antcin K 一起孵育可降低黏著斑激酶(FAK)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B (AKT) 和核因子-κB (NF-κB) 訊號級聯的磷酸化，所有這些信號級聯促進 RA 中細胞因子的產生。腹腔注射Antcin K（10 mg/kg 或30 mg/kg）可減輕膠原蛋白誘導關節炎(CIA) 的爪腫脹、軟骨退化和骨侵蝕，並降低TNF-α、IL-1β、IL-8 的血清水平老鼠；在進一步的實驗中，IL-6 水平也同樣降低。 Antcin K 對人類 RASF 中 TNF-α、IL-1β 和 IL-8 表現的抑製作用是透過下調 FAK、PI3K、AKT 和 NF-κB 訊號級聯來實現的。我們的數據支持使用Antcin K 來治療RA 疾病的臨床研究。 .jpg " alt="圖1" />

圖1

細胞激素的鑑定...

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細胞激素的鑑定幹擾 RA 嚴重程度的細胞激素。 (A, B) RA 和…

圖 1 幹擾 RA 嚴重程度的細胞激素的鑑定。 (A,B) RA 和正常滑膜組織標本採用 IHC 進行分析。 (C) RA 患者血漿細胞激素濃度上調。對 RA 患者和健康志願者的血液樣本 (N=6) 進行 ELISA 評估，以確定 TNF-α、IL-1β 和 IL-8 的水平。結果以平均值±SD表示。 *P＜與對照組相比為 0.05。

圖 2

< p> Antcin K 抑制TNF-α、IL-1β…

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Antcin K 抑制RASF 中TNF-α、IL-1β 和IL-8 的表達。 (A) 化學結構…

圖 2 Antcin K 抑制 RASF 中 TNF-α、IL-1β 和 IL-8 的表達。 (A) 化合物Antcin K 的化學結構。透過以下方法檢查細胞活力： (C–E) 將細胞與Antcin K (10 μM) 一起孵育24 小時，並透過人類發炎抗體陣列定量40 種發炎因子的表達( F。使用Antcin K（0.3、1、3 或10 μM）處理24 小時，透過qPCR、Western blot 和ELISA 評估TNF-α、IL-1β 和IL-8 mRNA 表現和蛋白分泌。 P <0.05

圖3

FAK 路徑參與…

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FAK 路徑參與Antcin K 誘導的TNF-α 抑制α、IL-1β 和…

圖3 FAK 路徑參與Antcin K誘導的RASF 中TNF-α、IL-1β 和IL-8 產生的抑制。 (A) 以Antcin K（0.3、1、3或10 μM）處理細胞24小時，並以Western blot檢測FAK磷酸化。 (B–D) 將細胞以 FAK 活化劑血管張力素 II 預處理 30 分鐘，然後以 Antcin K (10 μM) 處理 24 小時。以 qPCR、Western blot 和 ELISA 檢查 TNF-α、IL-1β 和 IL-8 mRNA 表現和蛋白質分泌。結果以平均值±SD表示。 *P＜與對照組相比 0.05； #P <與 Antcin K 治療組比較為 0.05。

圖 4

< p> PI3K 路徑參與…

圖4

PI3K 路徑參與Antcin K 誘導的TNF-α、IL-1β 和…的抑制

圖4 PI3K 路徑參與Antcin K 誘導的RASF 中TNF-α、IL-1β 和IL-8 產生的抑制。 (A) 以Antcin K（0.3、1、3或10 μM）處理細胞24小時，並以Western blot檢測PI3K磷酸化。 (B–D) 細胞以 PI3K 活化劑 740-YP 預處理 30 分鐘，然後以 Antcin K (10 μM) 處理 24 小時。以 qPCR、Western blot 和 ELISA 檢查 TNF-α、IL-1β 和 IL-8 mRNA 表現和蛋白質分泌。結果以平均值±SD表示。 *P＜與對照組相比 0.05； #P <與 Antcin K 治療組比較為 0.05。

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圖5

AKT 路徑參與Antcin K 誘導的TNF-α、IL-1β 和…的抑制

圖5 AKT 路徑參與Antcin K 誘導的滑膜纖維母細胞TNF-α、IL-1β 和IL-8 產生的抑制。 (A) 以Antcin K（0.3、1、3或10 μM）處理細胞24小時，並以Western blot檢測AKT磷酸化。將細胞以 AKT 活化劑 (SC-79) 預處理 30 分鐘，然後以 Antcin K (10 μM) 處理 24 小時。 (B–D)透過qPCR、Western blot和ELISA檢測TNF-α、IL-1β和IL-8 mRNA表現和蛋白質分泌。結果以平均值±SD表示。 *P＜與對照組相比 0.05； #P <與 Antcin K 治療組比較為 0.05。

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< p> NF-κB 路徑參與…

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NF-κB 路徑參與Antcin K 誘導的TNF-α、IL-1β 和… < /p> 圖6 NF- κB 路徑參與Antcin K 誘導的RASF 中TNF-α、IL-1β 和IL-8 產生的抑制。 (A) 以Antcin K（0.3、1、3或10 μM）處理細胞24小時，並以Western blot檢測NF-κB磷酸化。用 NF-κB 活化劑（前列腺素）預處理細胞 30 分鐘，然後用 Antcin K (10 μM) 處理 24 小時。 (B–D)透過qPCR、Western blot和ELISA檢測TNF-α、IL-1β和IL-8 mRNA表現和蛋白質分泌。 (E) 以NF-κB螢光素酶質粒轉染細胞，再與Antcin K（0.3、1、3或10 μM）孵育24小時，測定螢光素酶活性。結果以平均值±SD表示。 *P＜與對照組相比 0.05； #P <與 Antcin K 治療組比較為 0.05。

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圖7

Antcin K 改善了CIA 小鼠的爪子腫脹和軟骨退化。 (A) 工作流程...

圖 7 Antcin K 改善了 CIA 小鼠的爪子腫脹和軟骨退化。 (A) CIA 誘導和 Antcin K 注射的工作流程。 (B, C) 對健康對照、未治療的CIA 小鼠以及服用Antcin K 10 mg/kg 或30 mg/kg 48 週的CIA 小鼠的後爪腫脹進行拍照並用數字體積描記器進行測量。第 48 天記錄後爪的代表性顯微 CT 影像。 (F–I)以ELISA法分析血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8濃度。結果以平均值±SD表示。 *P＜與對照組相比 0.05； #P <與未治療的 CIA 小鼠相比為 0.05。

圖 8

< p> Antcin K 的作用量化…

圖8

透過CIA 踝關節的組織病理學變化來量化Antcin K 的作用…

圖8 Antcin K 的作用透過量化CIA 小鼠踝關節的組織病理學變化。 (A) 取自踝關節的組織學切片的代表性放大影像，以H&E 和Safranin-O 染色，並對健康人的TNF-α、IL-1β 和IL-8 抗體進行IHC 染色對照組、未治療的 CIA 小鼠和施用 Antcin K 10 mg/kg 或 30 mg/kg 的 CIA 小鼠（每組 N=6）。 (B–D) 以 IHC 評分定量 TNF-α、IL-1β 和 IL-8 表現。 （E，F）踝關節滑膜和鄰近組織發炎評分和病理學結果的量化（詳細資訊請參閱補充表1）。結果以平均值±SD表示。 *P＜與對照組相比 0.05； #P <與未治療的 CIA 小鼠相比為 0.05。

圖 9

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圖9

示意圖總結了Antcin K 抑制促發炎細胞因子產生的機制。 Antcin…

圖 9 示意圖總結了 Antcin K 抑制促發炎細胞因子產生的機制。 Antcin K 抑制人類 RA 滑膜成纖維細胞以及 CIA 小鼠血清和滑膜組織中 TNF-α、IL-1β 和 IL-8 的產生。這些抗發炎作用透過 FAK/PI3K、AKT 和 NF-κB 訊號級聯反應發生。 所有人物 (9)