液態發酵過程中牛樟芝生物合成安托醌醇需求的遺傳證據
摘要
牛樟芝固態發酵可產生多種泛醌化合物，如安托醌醇(AQ)。然而，AQ 在液態發酵 (LSF) 過程中幾乎不會合成。為了研究 AQ 合成的機制，在 LSF 中添加了三種前驅物（泛醌 0 UQ0、法呢醇和法呢基二磷酸 FPP）。結果表明，UQ0成功誘導AQ產生；然而，金合歡醇和FPP不能誘導AQ合成。限制AQ合成的前驅物是醌環，而不是異戊二烯側鏈。然後，建立了農桿菌介導的香樟轉化系統，並過度表現醌環修飾（coq2-6）和異戊二烯合成（HMGR，fps）基因。結果表明，過度表現異戊二烯側鏈合成基因並不能增加AQ的產量，但過度表現coq2和coq5可以顯著增加AQ的產量。這與前驅體的實驗結果一致。這顯示樟芝在LSF製程中缺乏修飾AQ醌環的能力。在修飾步驟中，UQ0 的異戊二烯化是 AQ 生物合成的關鍵步驟。此結果將有助於我們了解樟芝AQ生物合成所需的遺傳證據。 jpg" alt="圖1。 />
圖1.
不同濃度的影響...
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不同濃度的潮黴素的影響B對樟芝生長的影響…
圖1.不同濃度潮黴素B對樟芝S-29生長的影響。 A：樟芝S-29的細胞年齡為8天； B：香樟S-29的細胞年齡為31天。以20、40、60和80 mg/L潮黴素B的細胞生長情形及不含抗生素的平板作為對照。
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農桿菌介導的轉殖系統...
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農桿菌介導的轉化香樟 S-29 系統。 A：農桿菌的選擇…
圖2. 農桿菌介導的樟芝S-29 轉化系統。 A：選擇根癌農桿菌； B：樟芝S-29細胞年齡； C：香樟S-29生物質； D：根癌農桿菌LBA4404和樟芝S-29的共培養時間； E：共培養溫度； F：根癌農桿菌LBA4404濃度； G：乙醯丁香酮濃度； H：振盪持續時間； I：香樟S-29轉化子hyg基因的PCR檢測（wt：野生型；M：DL2000的Maker；1-6：香樟S-29轉化子）。結果表示為每個實驗組的平均值±SEM (n = 3)。使用Dunnett檢定的單因子變異數分析來評估資料之間差異的顯著性，顯著水準設定為p＜1。 0.05。
圖3.
評估外源添加的作用...
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評估外源添加的作用AQ 生物合成的前驅物。 A：色譜圖...
圖 3. 評估外源性加成前驅物對 AQ 生物合成的作用。 A：SSF 中香樟的色譜圖； B：LSF 中樟芝的色譜圖； C：AQ是UQ3的結構類似物； D：加入了 UQ0 的 LSF 中樟芝的色譜圖； E：添加法尼醇的 LSF 中樟芝的色譜圖； F：加入 FPP 的 LSF 中樟芝的色譜圖； G：加入 UQ0 和金合歡醇的 LSF 中樟芝的色譜圖； H：加入了 UQ0 和 FPP 的 LSF 中樟芝的色譜圖； I：不同組別的 AQ 和 Ac 產量。
圖 4.
重組質粒的建構...
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重組質粒的建構on pCAMBIA 1301 . A: A. Camphorata S-29…
圖4. 基於pCAMBIA 1301. A: A. Camphorata S-29 和目的基因（coq2、coq3、coq5、 coq6、fps、HMGR)； B：基於 pCAMBIA 1301 建立質粒並在根癌農桿菌 LBA4404 中進行驗證。 M、M1 和 M2 = 不同分子量的 DNA 標記。目標基因：q2 = coq2、q3 = coq3、q5 = coq5、q6 = coq6、HMGR = HMG-CoA 還原酶、fps = FPP 合成酶。 wt = 野生型。
圖 5.
香樟 S-29 的轉化…
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轉化香樟S-29 。 A：農桿菌介導的轉化體和 hyg 的檢測...
圖 5. 香樟 S-29 的轉化。 A：農桿菌介導的轉化體以及香樟S-29轉化體中hyg基因的檢測。 B：樟腦 S-29 轉化體在含有潮黴素 B 的 PDA 平板中生長。 wt = 野生型。
圖 6.
醌過度表現的影響...
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醌環過度表現的影響樟芝S-29 的修飾基因對...
圖6. 樟芝S-29 的醌環修飾基因過度表現對AQ 生物合成的影響。 A：不同轉化體中AQ和Ac的產量。 B：pCAMBIA1301轉化體的菌落形態和色譜圖。 C：pCAMBIA1301-coq2轉化子的菌落形態和色譜圖。 D：pCAMBIA1301-coq3轉化子的菌落形態和色譜圖。 E：pCAMBIA1301-coq5轉化體的菌落形態和色譜圖。 F：pCAMBIA1301-coq6轉化子的菌落形態和色譜圖。
圖7.
側鏈過度表現的影響...
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側鏈過度表現的影響樟芝 S-29 基因對 AQ…
圖 7. 樟芝 S-29 側鏈基因過度表現對 AQ 生物合成的影響。 A：不同轉化體中AQ和Ac的產量。 B：pCAMBIA1301轉化體的菌落形態和色譜圖。 C：pCAMBIA1301-fps 轉化子的菌落形態和色譜圖。 D：pCAMBIA1301-HMGR 轉化子的菌落形態和色譜圖。
圖 8.
AQ 合成的全域途徑...
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AQ 合成的全域途徑在香樟中。作為前驅物，...
圖 8. 樟腦中 AQ 合成的整體途徑。 UQ0作為前驅物可以顯著減少AQ的合成步驟。 所有人物 (8)