2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇，一種來自牛樟芝的苯類化合物，透過抑制MAPK/NF-κB 磷酸化和GDAP1L1/Drp1 易位來減輕銀屑病炎症

摘要

牛樟芝具有抗發炎、抗氧化和免疫調節活性。我們的目的是探索源自 A 的 2,4-二甲氧基-6-甲基苯-1,3-二醇 (DMD) 的抗銀屑病潛力。肉桂。以咪喹莫特（IMQ）活化的巨噬細胞為細胞模型，檢測DMD體外抗發炎作用。在 THP-1 巨噬細胞和骨髓來源的小鼠巨噬細胞中觀察到 DMD 對 IL-23 和 IL-6 的顯著高抑制。 DMD 處理的巨噬細胞的條件培養基可以減少嗜中性球遷移和角質細胞過度增生。 DMD 可以透過抑制絲裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 和 NF-κB 的磷酸化來下調細胞激素/趨化因子。我們也觀察到 DMD 介入對 GDAP1L1/Drp1 從細胞質到粒線體的易位的抑制。因此，粒線體裂變可能成為治療銀屑病發炎的新標靶。局部應用 DMD 後，經 IMQ 治療的乾癬小鼠模型顯示鱗屑、紅斑和皮膚增厚減少。與僅 IMQ 刺激相比，活性化合物使表皮厚度減少約 2 倍。 DMD 減少了病灶皮膚中浸潤巨噬細胞和嗜中性球的數量及其相關細胞激素/趨化因子的產生。 IMQ 處理皮膚的免疫染色顯示 DMD 對 GDAP1LI 和磷酸化 Drp1 具有抑製作用。本研究提供了 DMD 作為銀屑病炎症有效治療方式的潛在用途的見解。 -12-664425-g001.jpg" alt="圖1" />

圖1

DMD抑制IMQ誘導的發炎細胞激素…

圖1

DMD 抑制 THP-1 和 BMDM 中 IMQ 誘導的發炎細胞激素。 (A, B) 細胞活力…

圖 1 DMD 抑制 THP-1 和 BMDM 中 IMQ 誘導的發炎細胞激素。 (A, B) 分別與指定濃度的 IMQ 和 DMD 孵育 24 小時後，以 MTT 和台盼藍測定法測定 THP-1 細胞的細胞活力 (n=3)。 (C) DMD 處理後 IMQ 刺激的 THP-1 細胞中細胞激素的 RT-qPCR 分析 (n=3)。 (D) DMD 處理後 IMQ 刺激的 THP-1 細胞中細胞激素的 ELISA 分析 (n=3)。 (E) DMD 治療後 IMQ 刺激的 BMDM 中細胞激素的 ELISA 分析 (n=3)。顯示的數據代表三個獨立實驗。 GAPDH 作為內部對照。 *P＜ 0.05，**P＜0.05 0.01，且***P＜0.01與 IMQ 組相比為 0.001。數據表示為平均值±SEM。

圖2

< p> DMD 抑制IMQ 誘導的活化...

圖2

DMD 透過MAPK 和NF-κB 途徑抑制THP-1 細胞中IMQ 誘導的激活，並且...

> 圖2 DMD透過MAPK和NF-κB途徑抑制IMQ誘導的THP-1細胞活化，並阻斷嗜中性球侵襲和角質形成細胞增生。 (A) 對 DMD 處理後 IMQ 刺激的 THP-1 細胞中的趨化因子進行 RT-qPCR 分析 (n=4)。 (B) DMD 處理後 IMQ 刺激的 THP-1 細胞中 GDAP1L1 的 RT-qPCR 分析 (n=4)。 (C–E) 在有或沒有 DMD 的情況下用 IMQ 處理 THP-1 細胞。分別測定 NF-κB、MAPK 和 GDAP1L1 磷酸化的免疫印跡分析。 (F) 嗜中性球遷移是透過傷口癒合測定來測量。以 THP-1 細胞的條件培養基處理嗜中性球 24 小時，以確定遷移到刮痕區域的速率。透過測量 0 和 24 小時刮痕邊緣之間的距離來量化傷口癒合情況。 (G) 嗜中性球侵襲透過博伊登室侵襲測定法測量。中性粒細胞裝載在頂部室上。讓細胞侵襲 4 小時，並對侵襲率進行量化 (n=4)。 (H) 使用MTT和台盼藍法測定THP-1細胞條件培養基誘導的角質形成細胞增殖(n=3)。 (I) 以 THP-1 細胞條件培養基刺激 24 小時的角質形成細胞中 STAT3 磷酸化的免疫印跡。顯示了三分之一的獨立實驗。 *P＜ 0.05，**P＜0.05 0.01，且***P＜0.01與 IMQ 組相比為 0.001。數據表示為平均值±SEM。

圖3

< p> DMD 抑制IMQ 誘導的活化…

圖3

DMD 透過降低Drp1 磷酸化和GDAP1L1/Drp1 抑制IMQ 誘導的THP-1 細胞活化…

圖3 DMD 透過減少Drp1 磷酸化和GDAP1L1/Drp1 易位來抑制IMQ 誘導的THP-1 細胞活化。 (A) DMD 處理後 IMQ 刺激的 THP-1 細胞中 GDAP1L1 和 Drp1 S616 的免疫印跡。 (B) THP-1 細胞經 DMD 或 TBHQ 預處理，然後用 IMQ 或甲萘醌刺激 2 小時。將細胞分為胞質和粒線體部分，並進行免疫印跡測定以確定 GDAP1L1 和 Drp1。 (C) THP-1 細胞經 DMD 或 TBHQ 預處理，然後用 IMQ 或甲萘醌刺激 2 小時。將細胞分為胞漿和粒線體部分，並進行免疫印跡測定以確定 Drp1 及其磷酸化形式 (Drp1 S616)。 (D) THP-1 細胞以 IMQ 刺激 2 小時，然後以 MitoTracker Red 染色。將細胞固定並以 Drp1 S616 抗體進行免疫染色，然後進行共聚焦顯微鏡檢查。右圖顯示了所示組中的平均粒線體長度（μm）和粒線體長度分佈的比較。 (E) THP-1 細胞粒線體中 GDAP1L1 和 Drp1 的免疫沉澱，如免疫印跡所示。 (F) THP-1 細胞以 IMQ 刺激 2 小時，然後以 MitoTracker Red 染色。將細胞固定並以針對 GDAP1L1 或 Drp1 S616 的抗體進行免疫染色，然後進行共聚焦顯微鏡檢查。比例尺，10 μm。所有實驗重複兩三次，結果相似。

圖4

< p> DMD 減輕IMQ 誘發的乾癬樣發炎…

圖4

DMD 減輕小鼠模型中IMQ 誘發的乾癬樣發炎。 (A) 方案...

圖 4 DMD 減輕小鼠模型中 IMQ 誘導的乾癬樣發炎。 (A) IMQ 誘導的小鼠牛皮癬樣發炎模型中 AC 或 DMD 治療的實驗方案方案。 (B) 5 天后，經過和未經 AC 或 DMD 治療的小鼠皮膚上 IMQ 誘導的銀屑病樣炎症的表型和顯微圖像。 (C) 描述了累積分數（每個等級加上從 0 到 4 的紅斑）。 (D)在第6天測量TEWL。 (F) 使用影像分析系統測量 Munro 的微膿瘍。所有實驗至少進行三次。 **P＜ 0.01且***P＜0.01與 IMQ 組相比為 0.001。比例尺，100 μm。數據表示為平均值±SEM。 (n=6)。

圖5

< p> DMD 減輕IMQ 誘發的乾癬樣發炎…

圖5

DMD 減輕小鼠模型中由皮膚觀察到的IMQ 誘發的乾癬樣發炎… < /p>圖 5 透過皮膚組織學觀察，DMD 可減輕小鼠模型中 IMQ 誘導的乾癬樣發炎。 (A)透過H&E染色對皮膚進行組織學評估。 (B) 以 Ki67 染色對皮膚進行組織學評估。 (C) 以 Ly6G 染色對皮膚進行組織學評估。 (D) 以 F4/80 染色對皮膚進行組織學評估。 (E) 以 GDAP1L1 染色對皮膚進行組織學評估。 (F) 以 Drp1 S616 染色對皮膚進行組織學評估。每張影像的左上角表示紅框的較高倍率放大倍率。紅色箭頭表示抗體染色細胞的位置。抗體陽性細胞的定量顯示在每張圖的右圖。 ***P＜與 IMQ 組相比為 0.001。數據表示為平均值±SEM。 (n=9)。

圖6

< p> DMD 抑制...的表達

圖6

DMD 抑制IMQ 誘導的小鼠銀屑病病變中促炎介質的表達。圖6 DMD 抑制IMQ誘導的小鼠銀屑病樣病變中促發炎介質的表達。 (A–G) 連續5天用IMQ霜局部治療小鼠背部皮膚。如有必要，也可在病灶皮膚上局部塗抹AC或DMD。萃取皮膚總RNA，並以RT-qPCR（n=8−12）分別檢測IL-23、IL-6、IL-17A、IL-24、TNF、CXCL2和F4/80的mRNA量。 *P＜ 0.05，**P＜0.05 0.01，***P＜0.01與 IMQ 組相比為 0.001。數據表示為平均值±SEM。 (n=6)。

圖7

< p> 所提出的示意​​圖...

圖7

所提出的DMD 抗發炎作用機制的示意圖...

圖7 的示意圖提出了DMD 在巨噬細胞中抗發炎作用的機制。我們發現IMQ刺激誘導GDAP1L1表現和GDAP1L1依賴的Drp1 S616磷酸化，然後引起GDAP1L1和磷酸化Drp1 S616的粒線體易位，導致粒線體裂解。 IMQ 刺激也透過 NF-κB 和 MAPK 磷酸化的活化誘導發炎介質的表達，這是 GDAP1L1 依賴性的方式。我們證明 DMD 透過阻斷 GDAP1L1 依賴性 Drp1 S616 磷酸化和粒線體易位來阻止 IMQ 誘導的粒線體裂變。它可以抑制活化的巨噬細胞中促發炎介質的表達。 DMD 治療抑制了活化的巨噬細胞遷移到小鼠皮膚發炎部位。 DMD 治療可阻斷來自巨噬細胞的細胞激素和趨化因子進而拯救嗜中性球並導致表皮增生。 所有人物 (7)