牛樟芝中的 Antcin C 透過 Nrf2 依賴性機制在體外和體內保護肝細胞免受自由基誘導的氧化壓力和細胞凋亡
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antcin C 對AAPH 誘導的細胞死亡和ROS 生成的保護作用...
圖1 antcin的保護作用C 對 HepG2 細胞中 AAPH 誘導的細胞死亡和 ROS 生成的影響。 （a）antcin C 的化學結構。然後用AAPH (10mM)誘導氧化壓力24小時。透過MTT測定來測量細胞活力。根據對照細胞的百分比計算活細胞的百分比。 （c）用antcin C（5-20μM）或水飛薊素（100μM）預處理細胞2小時，然後用AAPH（10mM）誘導ROS產生30分鐘。使用螢光分光光度計對 DCF 染色細胞的螢光強度百分比進行定量，如材料和方法中所述。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。 *P＜ 0.05，**P＜0.05 0.01，且***P＜0.01 0.001 被認為對於樣品與 AAPH 而言是顯著的。 †P＜ 0.05 被認為對於對照組與 AAPH 具有顯著性。
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Antcin C誘導抗氧化基因…
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Antcin C 在AAPH 誘導的HepG2 細胞中誘導抗氧化基因表現。 (a) HepG2 細胞…
圖2 Antcin C 在 AAPH 誘導的 HepG2 細胞中誘導抗氧化基因表現。 (a) HepG2 細胞與antcin C (5–20μM) 或水飛薊素(100μM) 預孵育2小時，然後暴露於AAPH (10mM) 24小時。製備總細胞裂解物並進行蛋白質印跡分析，以監測抗氧化蛋白的表達水平，包括 HO-1、NQO-1、γ-GCLC 和 SOD。 β-肌動蛋白作為內部對照。 (b)antcin C 對抗氧化基因 mRNA 量的影響。 HepG2細胞與antcin C (5–20μM)或水飛薊素(100μM)預孵育2小時，然後暴露於AAPH (10mM) 6小時。以 RT-PCR 分析對 HO-1、NQO-1、γ-GCLC 的 mRNA 量進行半定量。 β-肌動蛋白作為上樣對照。 （c）HepG2細胞與antcin C（20μM）或水飛薊素（100μM）預孵育2小時，然後暴露於AAPH（10mM）6小時。進行 Q-PCR 分析以監測 HO-1、NQO-1、γ-GCLC 和 Nrf2 mRNA 水平的表達量。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。 *P＜ 0.05，**P＜0.05 0.01，且***P＜0.01 0.001 被認為對於樣品與 AAPH 而言是顯著的。 †P＜ 0.05 被認為對於對照組與 AAPH 具有顯著性。
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Antcin C促進轉錄活化...
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Antcin C 促進AAPH 誘導的HepG2 細胞中Nrf2 的轉錄活化。 (a) 細胞…
圖 3 Antcin C 促進 AAPH 誘導的 HepG2 細胞中 Nrf2 的轉錄活化。 (a)以antcin C (20μM)或水飛薊素(100μM)預處理細胞2小時，然後暴露於AAPH(10mM)1小時。製備核和細胞質裂解物並進行蛋白質印跡分析。監測Nrf2在細胞質和細胞核的累積。 (b) HepG2細胞以antcin C (5–20μM)或水飛薊素(100μM)預處理2小時，然後暴露於AAPH (10mM) 1小時。使用 Nrf2 特異性一抗體和異硫氰酸螢光素偶聯二抗體（綠色）透過免疫螢光法測量 AAPH 處理的 HepG2 細胞中 Nrf2 的蛋白質表現量。用螢光顯微鏡拍攝亞細胞和核分佈。 DAPI (1μg/mL) 用於對細胞核進行染色。 （c）使用lipofectamine以ARE質粒瞬時轉染HepG2細胞，並在有或沒有AAPH（10mM）的情況下與antcin C（20μM）或水飛薊素（100μM）預孵育2小時。將細胞裂解物與螢光素酶試劑混合後使用照度計進行定量。透過將處理細胞的相對螢光素酶單位 (RLU) 除以未處理細胞的 RLU 來計算相對 ARE 活性。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。 **P＜ 0.01 被認為對於樣品與 AAPH 而言是顯著的。 †P＜ 0.05 被認為對於對照組與 AAPH 具有顯著性。 (d) HepG2 細胞以針對 Nrf2 的特異性 siRNA 或非沉默對照轉染。轉染24小時後，細胞在有或沒有antcin C（20μM，2小時）的情況下孵育，並以AAPH（10mM）誘導2-24小時。以蛋白質印跡分析監測 HO-1、NQO-1 和 Nrf2 的蛋白質表現量。透過MTT測定測定細胞活力。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。 *P＜ AAPH 與對照 siRNA 中的樣本相比，0.05 被認為是顯著的。 †P＜ 0.05 被認為對於 AAPH 與 siNrf2 細胞中的樣本具有顯著性。
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的效果antcin C 對...
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antcin C 對HepG2 細胞中AAPH 誘導的MAPK 活化的影響。 ((a)–(d)) 細胞…
圖 4 antcin C 對 HepG2 細胞中 AAPH 誘導的 MAPK 活化的影響。 ((a)–(d))細胞以antcin C (5–20μM)或水飛薊素(100μM)或MAPK抑制劑(30μM)預處理2小時，然後暴露於AAPH (10mM) 15分鐘- 1小時。製備總細胞裂解物或核級分並進行蛋白質印跡分析。檢查了 p38 MAPK、JNK1/2 和 ERK1/2、PKC 和 PI3K 蛋白的磷酸化和非磷酸化形式。 β-肌動蛋白作為加載對照。
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Antcin C保護HepG2 細胞…
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Antcin C 保護HepG2 細胞免受AAPH 誘導的細胞凋亡。 (a) DNA 片段化......
圖 5 Antcin C 保護 HepG2 細胞免受 AAPH 誘導的細胞凋亡。 (a) AAPH 誘導的 HepG2 細胞中的 DNA 片段以 TUNEL 測定法測定，如材料與方法所述。三個獨立樣本的顯微視野（放大倍率×200）中 TUNEL 陽性細胞的平均數量。 (b) 透過與對照組相比的 TUNEL 陽性細胞的數量來確定凋亡細胞的百分比。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。 ***P＜ AAPH 與樣本相比，0.001 被認為是顯著的。 †P＜ 0.001 被認為對於對照組與 AAPH 具有顯著性。 （（c），（e），（f））HepG2細胞以antcin C（20μM）預處理2小時，然後暴露於AAPH 30分鐘。以免疫印跡檢測antcin C對AAPH誘導的胞質細胞色素c、caspase 9、caspase 3、PARP、Bcl-2和Bax（粒線體途徑）蛋白質水平的影響。 (g) 使用蛋白質印跡分析檢查 Caspase 4、Caspase 12 和 HSP70（ER 壓力路徑）。 (d)以antcin C在有或沒有caspase-3抑制劑Z-VAD-FMK (30μM)的情況下預處理細胞2小時，然後透過AAPH誘導細胞死亡24小時。透過MTT測定測定細胞活力。數值代表三個獨立實驗的平均值±SD。 **P＜ 0.01 被認為對於 AAPH 與樣本而言是顯著的。 †P＜ 0.01 被認為對於對照組與 AAPH 具有顯著性。
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Antcin C上調抗氧化基因…
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Antcin C 上調AAPH 挑戰的肝組織中的抗氧化基因。小鼠接受預處理…
圖 6 Antcin C 上調 AAPH 挑戰的肝組織中的抗氧化基因。小鼠以antcin C (25–200mg/kg)或水飛薊素(100mg/kg)預處理5天，然後以單一劑量的AAPH(80mg/kg)進行攻擊。處死小鼠，對肝臟切片進行免疫組織化學分析，使用特異性抗體分析HO-1、NQO-1和Nrf2的蛋白質表現量。透過Image-Pro Plus軟體對抗體陽性染色細胞的相對強度進行定量。結果以三個獨立實驗的平均值±SD 表示。 *P＜ 0.05，**P＜0.05 0.01，且***P＜0.01 0.001 被認為對於樣品與對照組而言顯著。
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示意圖antcin C 誘導的…
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antcin C 透過Nrf2/ARE 誘導抗氧化基因表現上調的示意圖…
圖7 antcin 的示意圖C 透過Nrf2/ARE 訊號路徑誘導抗氧化基因表現上調，並抑制AAPH 誘導的人類肝HepG2 細胞凋亡。 所有人物 (7)