牛樟芝半乳甘露聚醣透過 Toll 樣受體 4 引發免疫刺激活性
摘要
牛樟芝 (A. cinnamomea) 是一種傳統中醫藥用真菌，可治療多種疾病疾病，包括肝病、腹痛、藥物中毒、腹瀉、皮膚搔癢、高血壓和癌症。多醣體已被確定為A中存在的主要藥理活性成分之一。肉桂。本研究旨在研究從A.分離出的半乳甘露聚醣的免疫增強活性。肉桂。 A的冷水可溶性多醣(半乳甘露聚醣重複；MW＞70kDa；命名為ACP)。分離出肉桂，並透過包括小鼠巨噬細胞和人類樹突狀細胞在內的不同免疫細胞模型研究了免疫刺激特性。透過Toll 樣受體4，ACP 刺激J774A.1 小鼠巨噬細胞、小鼠腹膜巨噬細胞和人類樹突狀細胞中的腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 和白血球介素6 (IL- 6)。進一步發現，ACP 透過蛋白激酶 C-α (PKC-α) 和絲裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 磷酸化來引發其免疫刺激活性。此外 ACP透過抑制NF-κB發揮內毒素耐受樣作用。這些發現證明了 A 的潛力。肉桂半乳甘露聚醣作為免疫刺激劑或免疫治療和疫苗接種中的佐劑。 2024/12/ijbsv14p1378g001.jpg" alt="圖1" />
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八糖重複結構...
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八糖結構牛樟芝半乳甘露聚醣 (ACP) 的重複單元。
圖1 牛樟芝半乳甘露聚醣（ACP）八醣重複單元的結構。
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ACP誘導細胞因子表達在…圖2
ACP 誘導巨噬細胞和樹突狀細胞中的細胞激素表達。 ( A ) J774A.1… 圖2 ACP誘導巨噬細胞和樹突狀細胞中細胞激素的表達。 b>) J774A.1巨噬細胞在有或沒有多粘菌素B (PMB) (10 µg/mL) 的情況下孵育30 分鐘，然後在有或沒有ACP 或LPS (1 µg/mL) 的情況下孵育24 小時。以ELISA測定培養基中TNF-α的含量。 (B) J774A.1 巨噬細胞在有或沒有ACP (100 µg/mL) 或LPS (1 µg/mL) 的情況下孵育5.5 小時，然後在有或沒有ATP (5 mM) 的情況下孵育30 分鐘。以ELISA測定培養基中IL-1β的含量。 (C) J774A.1 巨噬細胞在有或沒有 ACP 或 LPS (1 µg/mL) 的情況下孵育 24 小時。以ELISA測量培養基中IL-6的含量。 (D) 將小鼠腹膜巨噬細胞在有或沒有 ACP 或 LPS (1 µg/mL) 的情況下孵育 24 小時。以ELISA測定培養基中TNF-α和IL-6的含量。 (E) 人類單核細胞衍生的樹突細胞在有或沒有 ACP 或 LPS (1 µg/mL) 的情況下孵育 24 小時。以ELISA測定培養基中TNF-α和IL-6的含量。數據表示為三個獨立實驗的平均值±SD。 ***表示在p＜1的水平上有顯著差異。 0.001。 L: LPS
圖 3
ACP透過…誘導細胞激素表達圖3
ACP 透過TLR4 誘導細胞激素表達。 ( A, B ) J774A.1巨噬細胞穩定…圖3 ACP透過TLR4誘導細胞激素表現。 b>)以對照shRNA 質粒(sh-SC)、TLR4 shRNA 質粒(sh-TLR4) 和TLR2 shRNA 質粒(sh-TLR2) 穩定轉染的J774A.1 巨噬細胞在有或沒有ACP（100 µg / mL)、PGN (10 µg/mL) 或 LPS (1 µg/mL)。以ELISA法測定培養基中TNF-α(A)及IL-6(B)的含量。 (C, D) 從野生型(WT) 和TLR4 敲除(TLR4-/-) 小鼠分離的小鼠腹膜巨噬細胞在有或沒有ACP (100 µg/mL) 、PGN 的情況下孵育24 小時(10 µg/mL) 或 LPS (1 µg/mL)。以ELISA法測定培養基中TNF-α(C)及IL-6(D)的含量。 (E) J774A.1 巨噬細胞在有或沒有ACP (100 µg/mL) 的情況下孵育30 分鐘，然後在有或沒有LPS (1 µg/mL) 的情況下孵育24 小時。以ELISA測定培養基中TNF-α的含量。數據表示為三個獨立實驗的平均值±SD。 ***表示在p＜1的水平上有顯著差異。 0.001。
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ACP誘導細胞因子表現透過…圖 4
ACP 透過 MAPK 誘導細胞激素表現。 ( A ) J774A.1巨噬細胞孵育…圖4 ACP透過MAPK誘導細胞激素表現。 .1巨噬細胞在有或沒有 ACP (100 µg/mL) 的情況下孵育 0-60 分鐘。透過Western blot檢測ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化程度。 (B, C) J774A.1 巨噬細胞穩定轉染對照 shRNA 質粒 (sh-SC)、ERK1 shRNA 質粒 (sh-ERK1)、JNK1 shRNA 質粒 (sh-TLR2)、 p38α shRNA質粒(sh-p38α) 和p38β shRNA 質粒(sh-p38β) 在有或沒有ACP (100 μg/mL) 的情況下孵育24 小時。以ELISA法測定培養基中TNF-α(B)及IL-6(C)的含量。蛋白質印跡結果代表了在三個不同實驗中獲得的結果。 ELISA 數據表示為三個獨立實驗的平均值±SD。 ***表示在p＜1的水平上有顯著差異。 0.001。
圖5
ACP 誘導細胞因子表現透過…圖 5
ACP 透過 PKC-α 誘導細胞激素表現。 ( A ) J774A.1巨噬細胞孵育…圖5 ACP透過PKC-α誘導細胞激素表現。 ) J774A .1 巨噬細胞在有或沒有 ACP (100 µg/mL) 的情況下孵育 0-60 分鐘。透過Western blot檢測PKC-α和PKC-δ的磷酸化程度。 (B) J774A.1 巨噬細胞穩定轉染對照 shRNA 質粒 (sh-SC)、PKC-α shRNA 質粒 (sh-PKC-α) 和 PKC-δ shRNA 質粒 (sh -PKC -δ) 在有或沒有ACP (100 μg/mL) 的情況下孵育24 小時。以ELISA測定培養基中TNF-α的含量。 (C) sh-SC、sh-PKC-α 和sh-PKC-δ 細胞在有或沒有ACP (100 μg/mL) 或LPS (1 μg/mL) 的情況下孵育24小時。透過Western blot檢測COX-2的表達量。蛋白質印跡結果代表了在三個不同實驗中獲得的結果。 ELISA 數據表示為三個獨立實驗的平均值±SD。 ***表示在p＜1的水平上有顯著差異。與 ACP 處理的 sh-SC 細胞相比為 0.001。
圖6
ACP預處理誘導LPS耐受性。 ( A, B ) J774A.1 巨噬細胞( A… 圖6 ACP 預處理誘導LPS 耐受。 ( A , B) J774A.1 巨噬細胞(A) 和小鼠腹膜巨噬細胞(B) 在有或沒有ACP (100 μg/mL) 的情況下孵育24 小時洗滌後，將細胞培養物更換為新鮮培養基，然後在有或沒有LPS (1 μg/mL)（第二次刺激）的情況下孵育24 小時。 24 小時。 NF 測量NF-κB 的活化程度。洗滌後，將細胞培養物更換為新鮮培養基，然後在有或沒有 LPS (1 µg/mL) 的情況下孵育 0-30 分鐘。透過Western blot檢測ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化程度。蛋白質印跡結果代表了在三個不同實驗中獲得的結果。數據表示為三個獨立實驗的平均值±SD。 ***表示在p＜1的水平上有顯著差異。 0.001，與第 1 個 P/第 2 L 組比較。 P：PBS； L：脂多醣。