從台灣樟腦中分離出的 Zhankuic Acid A 是一種具有抗發炎特性的新型選擇性 TLR4/MD-2 拮抗劑

數字

圖 1.

ZAA 抑制…的產生

圖 1.

ZAA 抑制發炎相關物質的產生LPS 和IFN-γ 刺激的小鼠巨噬細胞中的分子。 (A) 將小鼠腹腔巨噬細胞用或不用 ZAA 預處理 1 小時，然後用 LPS (0.5 μg/ml) 孵育 24 小時。對總細胞裂解物進行免疫印跡以檢測 COX2 和 iNOS。 COX2 和 iNOS 蛋白的相對表現量透過 ImageJ 軟體的光密度分析進行定量，並根據 β-肌動蛋白參考帶進行標準化。 (B) 小鼠腹腔巨噬細胞以 ZAA 預處理 1 小時，然後與 LPS (0.5 μg/ml) 或 IFN-γ (50 ng/ml) 孵育 24 小時。使用 Griess 測定分析培養基中亞硝酸鹽的存在，並用作 NO 水平的指示（n = 4。與 LPS 或 IFN-γ 誘導的細胞相比，*p < 0.05，***p < 0.001 ）。 (C) 以pNFκB-Luc和pβ-actin-LacZ質粒共轉染Raw264.7細胞。 48小時後，用或不用ZAA處理細胞1小時，然後用LPS（0.5μg/ml）處理24小時。收穫總細胞裂解物，測定其螢光素酶活性並根據β-半乳糖苷酶活性進行標準化。數值為平均值±SD（n=4。*p＜0.05，**p＜0.01，相對於LPS刺激的細胞）。 (D 和 E) ZAA 抑制 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞中的 NF-κB、MAPK 和 Akt 訊號路徑。用 ZAA 處理細胞 1 小時，然後用 LPS (0.5 μg/ml) 刺激 30 分鐘。以免疫印跡檢查總細胞裂解物中所示的蛋白質。 (D) 中印跡下方的數字和 (E) 中印跡下方表格中顯示的數字代表使用 ImageJ 軟體透過光密度分析定量並根據 β-肌動蛋白參考帶標準化的相對錶達量。在三個獨立實驗中獲得了類似的結果。 N.D.，無法偵測到。

圖2.

ZAA 與疏水性結合袋相互作用...

圖2.

ZAA 與疏水性結合袋相互作用MD-2。 ( A ) ZAA…

圖 2. ZAA 與 MD-2 的疏水結合袋相互作用。 (A) ZAA 採取相符的配置以裝入原本被 LPS 佔據的結合袋中。 MD-2 的剪切表面模型（PDB 條目：3FXI）與帶狀模型一起表示，以描繪埋在 MD-2 蛋白內部的 LPS 結合袋。洋紅色所示的胺基酸 Gly110–Asn158 位於 MD-2 aas 110–160 的免疫原性勝肽片段內，位於 MD-2 帶狀模型中的 ZAA 結合位點周圍。 Gly110 和 Asn158 以箭頭表示。 (B) 顯示了 ZAA 與 MD-2 結合口袋內疏水性氨基酸殘基結合所涉及的相互作用。 (C) 在 3FXI MD-2 模型的複雜結構中，對接的 ZAA 構象異構體（以黑色表示）疊加在 LPS 的末端碳鏈上。 (D) 重組人類MD-2 蛋白(0.15 μg) 與LPS (1 或10 μg) 或ZAA 一起孵育3 小時，進行天然PAGE，並使用針對不同抗原決定簇的Abs 進行免疫印跡。 (E) 重組人TLR4/MD-2 複合物(1 μg) 與LPS (10 μg) 或ZAA 一起孵育3 小時，進行天然PAGE，並使用針對MD-2 的Ab 進行免疫印跡（氨基酸 110–160）。在三個獨立實驗中獲得了類似的結果。

圖3.

ZAA 抑制TNF-α 和IL-6...

圖3.

ZAA 抑制TNF- LPS 或豬霍亂沙門氏菌處理的RAW264.7 細胞中α 和IL-6 的產生…

圖3. ZAA 抑制LPS 或豬霍亂沙門氏菌處理的RAW264.7 細胞中TNF-α 和IL-6的產生老鼠。將 96 孔板中的 RAW264.7 細胞（2 × 104 個細胞/孔）與 ZAA 一起孵育 1 小時，然後用 (A) LPS（0.25 或 0.5 μg/ml）或(< b>C) 豬霍亂沙門氏菌(2 × 103 CFU/孔)。 4 小時和 6 小時後收集的上清液分別以 ELISA 評估 TNF-α 和 IL-6 濃度。 (B) C3H/HeJ 和 C3H/HeN 小鼠經腹膜內預處理。以 2 mg/kg ZAA 處理 30 分鐘，然後腹腔內注射。注射4mg/kg LPS。 (D) C57BL/6 小鼠以 10 mg/kg ZAA 預處理 30 分鐘，然後口服豬霍亂沙門氏菌 (2 × 109 CFU/小鼠)。 6小時後以ELISA測量血漿中TNF-α和IL-6的濃度。數值為平均值±SD (n = 6–8)。至少三個獨立實驗獲得了類似的結果。 *p＜ 0.05，**p＜0.05 0.01，***p＜0.01 0.001。 S.C.，豬霍亂沙門氏菌。

圖4.

ZAA 減少LPS 引起的病理變化…

圖4.

ZAA 減少LPS 引起的病理變化小鼠的變化。 ( A–D ) C3H/HeN 和 C3H/HeJ…

圖 4.ZAA 減少 LPS 誘導的小鼠病理變化。 (A–D) C3H/HeN 和 C3H/HeJ 小鼠經腹膜內預處理。以 ZAA (20 mg/kg) 或載體混合 30 分鐘，然後腹腔內注射。含 LPS（4 毫克/公斤）。 10小時後，處死小鼠，取出肺部和腎臟組織。 (A) 顯示了肺和腎組織蘇木精和伊紅染色切片的代表性顯微圖像。比例尺，20 μm。原始放大倍率×200。 (B)透過光學顯微鏡觀察每個肺泡中浸潤的PMN的數量。對每隻小鼠每張幻燈片的四個隨機選擇的視野中的 PMN 數量進行計數，並標準化為肺泡數量。 (C 和 D) ZAA 降低 BUN (C) 和血清肌酸酐 (D) 的水平。 (B)–(D) 中顯示的值是平均值±SD（n = 10。**p < 0.01，***p < 0.001）。 (E) 經腹膜內預處理的 C3H/HeN 和 C3H/HeJ 小鼠。腹腔內注射 ZAA（2 或 10 mg/kg）或載體 30 分鐘。使用致死劑量的 LPS (20 mg/kg)。監測存活時間，並顯示四組中的Kaplan-Meier存活曲線(n＝10。***p＜0.001，與LPS處理的C3H/HeN小鼠相比)。至少三個獨立實驗獲得了類似的結果。

圖 5.

ZAA 改善豬霍亂沙門氏菌誘發的…

圖 5.

ZAA 改善豬霍亂沙門氏菌 –誘發的腹瀉、體重減輕和感染…

圖5.ZAA 改善豬霍亂沙門氏菌誘發的腹瀉、體重減輕和胃腸道感染。 (A 和 B) 經腹膜內預處理的 C57BL/6 小鼠。將 ZAA（2 或 10 mg/kg）或載體與卡那黴素抗性豬霍亂沙門氏菌（2 × 109 CFU/小鼠）口服給藥 30 分鐘。 (A) 2 天後以 0-3 等級對腹瀉進行評分（0 = 正常顆粒，1 = 輕微疏鬆糞便，2 = 疏鬆糞便，3 = 水樣腹瀉）。 (B) 每 2 天記錄一次體重，持續 2 週（n = 9-12；**p < 0.01，***p < 0.001）。 (C) 每隔 24 小時收集糞便樣本，直到豬霍亂沙門氏菌感染後 96 小時，並評估活細菌 CFU 數（n = 10；**p < 0.01，***p < 0.001）。 (D 和 E) 口服 ZAA (2 mg/kg) 或載體 30 分鐘的 C57BL/6 小鼠，口服施用 pCMV-Luc 轉化的金黃色葡萄球菌。豬霍亂(2 × 108 CFU/小鼠)。 48小時後，注射d-螢光素後對小鼠進行生物發光成像。 (D) 顯示全身影像。光子通量尺度如右圖所示。 (E) 生物發光成像資料的量化。輻射值表示為平均值±SD(***p＜0.001)。 S.C.，豬霍亂沙門氏菌。