Eburicoic Acid 是一種來自椴木栽培牛樟芝子實體的活性三萜類化合物，可誘導人類肝癌細胞內質網壓力介導的自噬
摘要
牛樟芝是台灣特有的藥用菌，可調控生物活性，包括保肝、抗發炎、抗乙型肝炎病毒活性、抗癌活性等。本研究中，利用人類肝癌Hep 3B 細胞研究了牛樟芝（來自椴木栽培牛樟芝子實體中第二豐富的三萜類化合物）的抗肝癌活性和分子機制。結果顯示，依布酸在24小時內有效降低Hep 3B細胞活力，IC50為18.4 μM，相當於8.7 μg/mL。此外，依布酸誘導LC3-I轉化為LC3-II的以及大量自噬體/自溶小體的形成。深入研究分子機制，發現烏布酸首先促進活性氧生成和ATP消耗，導致內質網應激，隨後升高胞質鈣離子濃度和BiP表達，下調DAPK磷酸化，上調Beclin-1磷酸化、JNK和Bcl-2，最終誘導Hep 3B 細胞自噬作用。這些結果表明，乙二酸具有顯著的抗肝癌作用和更獨特的作用機制。
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圖1
牛油酸對…的影響
圖1
牛油酸對Hep 3B 細胞培養後細胞活力的影響… < /p> 圖1 乙二酸對Hep 3B細胞細胞活力的影響將細胞與0、10、20和30μM乙二酸孵育12、24和48小時後，以MTT法測定細胞活力。數據表示為陰性對照（0.3% DMSO）的百分比。 
圖2
< p> 牛油酸對…的影響圖2
牛油酸對Hep 3B 細胞形態的影響孵化後…
圖2 牛油酸對細胞的影響Hep 3B細胞的形態學將細胞與(A)0、(B)10、(C)20和(D)30μM牛尿酸孵育24小時後，透過倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。
圖3
< p> 牛油酸對…的影響圖3
牛油酸對Hep 3B 細胞中細胞大小和顆粒度的影響…
圖3 牛油酸對細胞的影響Hep 3B 細胞的大小和粒度將細胞與 0、10、20 和 30 μM 牛尿酸孵育 24 小時後，透過流式細胞儀分析細胞 (A) 大小和 (B) 粒度。不同的字母(a-c)代表處理之間統計上顯著的差異(p＜0.05)。
圖4
< p> 牛油酸對…的影響圖4
牛油酸對Hep 3B 細胞亞二倍體期百分比的影響…
圖4 牛油酸對百分比的影響Hep 3B 細胞中亞二倍體相的百分比將細胞與(A) 0、(B) 10、(C) 20 和(D) 30 μM 烏布酸孵育48 小時後，亞二倍體相（亞G1 相）的百分比透過流式細胞儀進行分析。
圖5
< p> 牛油酸對…的影響圖5
牛油酸對Hep 3B 細胞破碎程度的影響…
圖5 牛油酸對程度的影響Hep 3B 細胞中細胞破碎的程度將細胞與0、10、20 和30 μM 牛尿酸和裂解液一起孵育24 小時後，透過LDH 滲漏測定來確定細胞破碎程度。數據以陽性對照（裂解液）和陰性對照（0.3% DMSO）之間的百分比表示。
圖6
< p> 牛油酸對…的影響圖6
牛油酸對Hep 3B細胞中LC3分佈的影響孵育後…
圖6 牛油酸對LC3的影響Hep 3B細胞中的分佈將細胞與(A)0、(B)10、(C)20和(D)30μM牛尿酸孵育24小時後，透過免疫螢光觀察LC3分佈。箭頭表示自噬體/自溶小體。
圖7
< p> 牛油酸對…的影響圖7
牛油酸對Hep 3B 細胞中自噬體形成量的影響…
圖7 牛油酸對自噬體形成量的影響Hep 3B 細胞中自噬體形成的影響 將細胞與 0、10、20 和 30 μM 牛尿酸孵育 24 小時後，以流式細胞儀分析自噬體形成的量。不同的字母(a-c)代表處理之間統計上顯著的差異(p＜0.05)。
圖8
< p> Eburicoic Acid on…圖8
Eburicoic Acid on ROS Generation in Hep 3B cells 孵育後…
圖8 Eburicoic Acid on ROS 在 Hep 3B 細胞中的ROS 生成將細胞與0、10、20 和30 μM 牛尿酸孵育2 小時後，以流式細胞儀分析ROS 生成。不同的字母(a-d)代表處理之間統計上顯著的差異(p＜0.05)。
圖9
< p> 牛油酸對…的影響圖9
牛油酸對Hep 3B 細胞中ATP 水準的影響孵育後…
圖9 牛油酸對ATP 的影響Hep 3B 細胞中的 ATP 水平將細胞與 0、10、20 和 30 μM 牛尿酸孵育 24 小時後，透過生物發光測定 ATP 水平。不同的字母(a-d)代表處理之間統計上顯著的差異(p＜0.05)。
圖10
< p> 牛油酸對…的影響圖10
牛油酸對Hep 3B 細胞中Ca 2+ 動員的影響…之後…
圖10 牛油酸對…的影響Hep 3B 細胞中的 Ca2+ 動員 將細胞與 0、10、20 和 30 μM 牛毛酸孵育 30 分鐘後，以流式細胞儀分析 Ca2+ 動員情況。不同的字母(a-d)代表處理之間統計上顯著的差異(p＜0.05)。
圖11
< p> 依布酸對…的影響圖11
依布酸對Ca 2+ 訊號相關蛋白和LC3表現的影響…
圖11 依布酸的影響酸對 Hep 3B 細胞中 Ca2+ 訊號相關蛋白和 LC3 表現的影響 將細胞與 0、10、20 和 30 μM 牛尿酸孵育 24 小時後，透過 Western blotting 評估 Ca2+ 訊號相關蛋白和 LC3 的表達。以 β-肌動蛋白歸一化密度測定法將蛋白質水平表示為陰性對照 (0.3% DMSO) 的倍數，並顯示在每個條帶的底部。
圖12
< p> 牛油酸對…的影響圖12
牛油酸對肝癌中未折疊蛋白反應相關蛋白表現的影響…
圖12 牛油酸的影響Hep 3B 細胞中未折疊蛋白反應相關蛋白表現的影響 將細胞與 0、10、20 和 30 μM 牛尿酸孵育 24 小時後，透過蛋白質印跡評估未折疊蛋白反應相關蛋白的表達。以 β-肌動蛋白歸一化密度測定法將蛋白質水平表示為陰性對照 (0.3% DMSO) 的倍數，並顯示在每個條帶的底部。
圖13
< p> 建議的牛油酸模型…圖13
建議的牛油酸誘導人類肝癌Hep 3B 細胞凋亡模型…
圖13 建議的牛油酸誘導模型人類肝癌Hep 3B細胞中的細胞凋亡粗箭頭表示我們結果中的表現變化。 所有人物 (13)