CCM111透過協同抑制TGF-β、Wnt和STAT3訊號路徑預防肝纖維化
摘要
CCM111 是牛樟芝 (AC) 的水萃取物，具有抗肝纖維化功能。然而，AC抗肝纖維化作用的詳細機制尚未闡明。目前的研究表明，CCM111顯著降低肝臟酵素標記谷氨酸草酰乙酸轉氨酶（GOT）和谷氨酸丙酮酸轉氨酶（GPT）的水平，防止肝損傷和膠原蛋白沉積，並以劑量依賴性方式下調TGF-β/Smad訊號傳導與單獨 CCl4 處理比較。透過新一代定序，CCM111 顯著抑制肝臟中 TGF-β、Wnt 和 STAT3 訊息傳遞路徑調節的下游基因。 CCM111 的抗纖維化機制在 HSC-T6 細胞中進一步證實。我們的數據首次證明CCM111可以透過協同抑制TGF-β、Wnt和STAT3依賴性促發炎和促纖維化介質來預防CCl4誘導的肝纖維化，這表明CCM111可能是預防和治療慢性肝纖維化的候選藥物。 />
圖1
CCM111 抑制肝臟形態…
圖1
CCM111 抑制CCl 4 的肝臟形態- 接受治療的動物。 (A) 影像...
圖 1 CCM111 抑制 CCl4 處理動物的肝臟形態。 (A)分別以H&E染色劑和天狼星紅/固綠染色劑染色的肝組織切片的影像。切片在 200 倍放大倍率下成像。 (B) 天狼星紅/固綠染色的定量。所有數值均表示為平均值±SD (n = 6)。學生 t 檢定：*P 值 < 0.05，**P值< 0.01，***P值<正常與 CCl4 為 0.001。 #P值< 0.05，##P值< 0.01，###P值< 0.001，CCl4 與 SIL、L-CCM111 或 H-CCM111 分別。
圖2
< p> CCM111 減少TGF-β1 誘導的表達...圖2
CCM111 減少TGF-β1 誘導的α-SMA 和MMP2 表達以及TGF 的活化-β…< /p> 圖2 CCM111 降低了CCl4 處理動物中TGF-β1 誘導的α-SMA 和MMP2 表現以及TGF-β 訊號路徑的活化。以蛋白質印跡分析總肝細胞裂解物的 α-SMA、MMP2、p-Smad2、p-Smad3、TGF-β1 和 Smad3 蛋白表現。 β-肌動蛋白是上樣對照。定量數據報告為三個獨立實驗的平均值±標準差。學生 t 檢定：*P 值 < 0.05，**P值< 0.01，***P值<正常與 CCl4 為 0.001。 #P值< 0.05，##P值< 0.01，###P值< 0.001，CCl4 與 SIL、L-CCM111 或 H-CCM111 分別。 
圖3
< p> 評估差異表達的基因...圖3
評估肝臟樣本中差異表達的基因。肝臟樣本透過以下方式進行分析：
圖 3 評估肝臟樣本中差異表達的基因。透過次世代定序分析肝臟樣本。透過各組相對於正常組的RPKM計算倍數變化。 (A) TGF-β途徑基因。 (B) TGF-β 途徑的下游基因。 (C) ECM 基因。 (D) 細胞激素。 (E) Wnt 途徑的下游基因。 (F) STAT3 途徑的下游基因。
圖4
< p> CCM111 減少TGF-β1 誘導的表達...圖4
CCM111 減少TGF-β1 誘導的α-SMA 和MMP2 表達以及TGF 的活化-β…< /p> 圖4 CCM111 降低了HSC 中TGF-β1 誘導的α-SMA 和MMP2 表現以及TGF-β 訊號路徑的活化。 (A) 以 CCM111 (0、5、10、30、60、120 或 160 μg/ml) 處理細胞 24 小時。以阿拉瑪藍測定法檢測增殖。 (B) 將細胞飢餓 24 小時，並以 TGF-β1 (1 ng/ml) 和 CCM111 (0、60、120 或 160 μg/ml) 處理 1 小時。 (C) 將細胞飢餓 24 小時，並以 TGF-β1 (1 ng/ml) 和 CCM111 (160 μg/ml) 處理 0.5、1 和 1.5 小時。製備總細胞裂解物以進行蛋白質印跡分析以檢測蛋白質量。 β-肌動蛋白是上樣對照。定量數據報告為三個獨立實驗的平均值±標準差。進行學生 t 檢定以比較 CCM111 組與僅 TGF-β1 組。 *P值< 0.05，**P值< 0.01 且 ***P 值 < 0.001。 
圖5
< p> CCM111 減少TGF-β1 誘導的活化...圖5
CCM111 減少TGF-β1 誘導的Wnt 和STAT3 訊號路徑的活化... < /p>圖5 CCM111減少TGF-β1誘導的HSC細胞中Wnt和STAT3訊息傳遞路徑的活化。將細胞飢餓 24 小時，並以 TGF-β1 (2 ng/ml) 和 CCM111 (0、60、120、160 μg/ml) 處理 24 小時。 (A)檢測p-STAT3和STAT3的蛋白質量。 (B) 檢測β-catenin表現的蛋白質量。 β-肌動蛋白作為胞質內參，核纖層蛋白B1作為核內參。定量數據報告為三個獨立實驗的平均標準偏差。 Student t 檢定將 CCM111 治療組與僅 TGFβ1 組進行了比較。 *P值< 0.05，**P值< 0.01 且 ***P 值 < 0.001。對照組與僅 TGF-β1 組。 #P值< 0.05，且###P值＜0.05 0.001。 
圖6
< p> CCM111 顯著減輕了嚴重程度...圖6
CCM111 透過以下方式顯著減輕了CCl 4 誘導的肝纖維化的嚴重程度
圖6 CCM111透過抑制 TGF-β1/Smad、Wnt 和 STAT3 路徑以及 ECM 蛋白和細胞激素的表達，顯著減輕 CCl4 誘導的肝纖維化的嚴重程度。 CCM111在CCl4誘導的實驗性纖維化中表現出保肝作用，暗示其在臨床幹預中的潛在應用。