Antcin K 是一種來自椴木栽培牛樟芝子實體的活性三萜類化合物，可誘導人類肝癌細胞線粒體和內質網壓力介導的細胞凋亡
Abstract
根據2011年統計，肝癌是台灣第二大癌症死亡原因，在全球癌症相關死亡率中排名第四。最近的研究表明，台灣特有的藥用菌牛樟芝具有保肝、抗發炎、抗乙型肝炎病毒活性和抗癌活性等生物活性。在本研究中，使用人類肝癌 Hep 3B 細胞研究了antcin K（來自椴木栽培的A. cinnamomea 子實體中最豐富的麥角甾烷三萜類化合物）的抗增殖活性和分子機制。結果顯示antcin K在48小時內有效降低Hep 3B細胞的活力。 Antcin K 誘導磷脂酰絲氨酸暴露、染色質濃縮和 DNA 損傷，但不會顯著增加自噬體含量或引起細胞擴張和細胞裂解。因此，antcin K誘導的Hep 3B細胞死亡的主要模式是細胞凋亡，而不是自噬或壞死。深入研究分子機制發現，antcin K首先促進活性氧的產生和三磷酸腺苷的消耗，導致內質網應激，導致粒線體膜通透性改變。粒線體膜電位喪失後，Caspase非依賴性和Caspase依賴性凋亡相關蛋白被釋放，包括HtrA2、凋亡誘導因子、核酸內切酶G和細胞色素c。細胞色素c活化caspase-9和caspase-3，並切割下游蛋白PARP，最終導致細胞凋亡。這些結果表明，antcin K 誘導人類肝癌細胞中粒線體和內質網壓力介導的細胞凋亡。結合這些發現，antcin K 有潛力成為肝癌治療的補充藥物。
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圖. 1
(A) 高效能色譜圖...
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(A) 純化化合物antcin K 的高效色譜圖(保留時間6.5 分鐘） ...
圖1 (A) 純化化合物antcin K 的高效率層析圖（保留時間6.5 分鐘）。條件：色譜管柱，COSMOSIL 5C18-AR-II RP-C18；流速，1 毫升/分鐘；檢測器，254 nm；流動相，甲醇(70%)/水(30%)。 (B)antcin K 對 Hep 3B 細胞活力的影響。將細胞與0μM、80μM、100μM和125μM antcin K孵育24小時和48小時後，以MTT測定測定細胞活力。數據表示為陰性對照 (0.2% DMSO) 的百分比和三個獨立實驗之一的平均值±SD。 (C)antcin K對Hep3B細胞中LC3-II螢光強度的影響。將細胞與0μM、80μM、100μM和125μM antcin K孵育48小時後，以流式細胞儀分析LC3-II螢光強度的程度。 (D)antcin K 對 Hep 3B 細胞細胞破壞程度的影響。將細胞與0μM、80μM、100μM和125μM antcin K和裂解液一起孵育48小時後，以LDH滲漏測定測定細胞破碎程度。數據表示為陽性對照（裂解液）和陰性對照（0.2% DMSO）之間的百分比以及來自三個獨立實驗之一的平均值±SD，並使用單向變異數分析和鄧肯檢定進行統計分析。不同的字母 (a–d) 代表處理之間具有統計顯著差異 (p < 0.05)。 ANOVA = 變異數分析； DMSO = 二甲基亞砜； LDH = 乳酸脫氫酶； SD = 標準差。
圖 2
(A ) 染色質濃縮檢測…
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(A) 以DAPI染色檢測Hep 3B細胞中染色質濃縮。典型…
圖 2 (A) 以 DAPI 染色檢測 Hep 3B 細胞中的染色質濃縮。典型的細胞凋亡變化包括染色質的濃縮、其沿著細胞核外圍的存在以及細胞核的分割。以 0μM、80μM、100μM 和 125μM antcin K 處理細胞 24 小時。使用 420 nm 屏障濾光片在 330–385 nm 處激發，使細胞核的 DAPI 螢光可視化。實驗重複兩次，結果相似。 (B) 以彗星試驗檢測 Hep 3B 細胞中的 DNA 損傷。以 0μM、80μM、100μM 和 125μM antcin K 處理細胞 24 小時。 DNA 的 EtBr 螢光透過使用 590 nm 屏障濾光片在 510–550 nm 處激發來可視化。實驗重複兩次，結果相似。 (C)antcin K 對 Hep 3B 細胞中鈣離子動員的影響。將細胞與 0μM、80μM、100μM 和 125μM antcin K 孵育 30 分鐘後，以流式細胞儀分析 Fluo 3-Ca 複合物。 (D)antcin K 對 Hep 3B 細胞中線粒體鈣分佈的影響。將細胞與0μM和125μM antcin K孵育30分鐘後，透過免疫螢光觀察粒線體鈣分佈。將細胞固定並以 Rhod-2-AM（紅色螢光）染色。然後用 DAPI（藍色螢光）對細胞中的核 DNA 進行複染色。記錄並疊加（合併）螢光影像。數據表示為三個獨立實驗之一的平均值±SD，並使用單向變異數分析和鄧肯檢定進行統計分析。不同的字母 (a–c) 代表處理之間具有統計顯著差異 (p < 0.05)。 ANOVA = 變異數分析； DAPI = 4,6-二脒基-2-苯基吲哚； MFI = 平均螢光強度； Rhod-2-AM = Rhod-2-乙醯氧基甲酯； SD = 標準差。
圖 3
(A ) 凋亡細胞的百分比...
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(A) antcin K 處理的Hep 3B 細胞誘導凋亡細胞的百分比。細胞…
圖 3 (A) antcin K 處理的 Hep 3B 細胞誘導凋亡細胞的百分比。將細胞暴露於 0μM、80μM、100μM 和 125μM antcin K 24 小時，並以膜聯蛋白 V-FITC/PI 測定評估細胞凋亡的分佈（右下圖）。 Antcin K 對 Hep 3B 細胞中 ROS 生成和 ADP/ATP 比值的影響。 (B)將細胞與0μM、80μM、100μM和125μM antcin K孵育24小時後，以流式細胞儀分析DCFH-DA的螢光強度。 (C)antcin K 對 Hep 3B 細胞中 DiOC6 螢光強度程度的影響。將細胞與0μM、80μM、100μM和125μM antcin K孵育48小時後，以流式細胞儀分析粒線體膜電位。 (D) 將細胞與 0μM、80μM、100μM 和 125μM antcin K 孵育 48 小時後，以生物發光測定 ADP/ATP 比值。數據表示為三個獨立實驗之一的平均值±SD，並使用單向變異數分析和鄧肯檢定進行統計分析。不同的字母 (a–d) 代表處理之間具有統計顯著差異 (p < 0.05)。 ADP/ATP = 二磷酸腺苷/三磷酸腺苷； ANOVA = 變異數分析； DCFH-DA = 二氫二氯螢光素二乙酸酯； DiOC6 = 3,3'-二己基氧羰花青碘化物； MFI = 平均螢光強度； PI = 碘化丙啶； ROS = 活性氧； SD = 標準差。
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(A ) antcin K 的影響…
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(A) antcin K 對粒線體表現和ER 壓力介導的影響…
圖4 (A) )antcin K對Hep 3B細胞中粒線體和ER壓力介導的凋亡相關蛋白質表現的影響。將細胞與0μM、80μM、100μM和125μM antcin K孵育48小時後，以蛋白質印跡評估粒線體和ER壓力介導的凋亡相關蛋白的表達。實驗至少重複兩次，結果相似，並使用 β-肌動蛋白作為上樣對照。以 β-肌動蛋白標準化密度測定法將蛋白質水平表示為陰性對照 (0.2% DMSO) 的倍數，並顯示在每個條帶的底部。 antcin K 對 Hep 3B 細胞中 (B) caspase 依賴性和 (C) caspase 非依賴性凋亡相關蛋白表現的影響。將細胞與 0μM、80μM、100μM 和 125μM antcin K 孵育 48 小時後，以蛋白質印跡評估蛋白質的表達。實驗至少重複兩次，結果相似，並使用 β-肌動蛋白作為上樣對照。以 β-肌動蛋白標準化密度測定法將蛋白質水平表示為陰性對照 (0.2% DMSO) 的倍數，並顯示在每個條帶的底部。 CHOP = C/EBP 同源蛋白； Bcl-xL = B 細胞淋巴瘤 2； Bax = B 細胞淋巴瘤 — 特大； DMSO = 二甲基亞砜； ER = 內質網。
圖 5
可能的儲存格死亡機制途徑...
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antcin K在人類肝癌Hep中可能的細胞死亡機制途徑...
圖5 antcin K可能的細胞死亡機制途徑在人類肝癌 Hep 3B 細胞。 ADP/ATP = 二磷酸腺苷/三磷酸腺苷； AIF = 凋亡誘導因子； CHOP = C/EBP 同源蛋白； Bcl-xL = B 細胞淋巴瘤 2； Bax = B 細胞淋巴瘤 — 特大； Endo-G = 核酸內切酶 G； ROS = 活性氧。