透過與生薑共培養增強牛樟芝對肝細胞癌細胞的抗癌活性：對癌細胞生存途徑的影響

摘要

牛樟芝 (AC) 是一種藥用真菌，在台灣傳統上廣泛用於治療包括癌症在內的多種健康相關疾病。除了能夠促進多種人類腫瘤中的癌細胞死亡之外，它還具有有效的抗炎和抗氧化特性。我們的目的是透過與生薑共培養來調整活性成分，以提高AC對肝細胞癌（HCC）的抗癌活性。使用 HCC 細胞系 Huh-7 和 HepG2 研究 AC (EAC) 乙醇萃取物單獨或與生薑共培養後的體外抗癌活性（EACG）。結果表明，AC與生薑的共培養顯著誘導了重要三萜類化合物的產生，並且EACG在靶向HCC細胞系方面比EAC更有效。 MTT 測定、細胞週期分析、Annexin V 測定和 caspase-3 活化表明，EACG 透過誘導 Huh-7 和 HepG2 細胞細胞週期停滯在 G2/M 期並誘導細胞凋亡，有效抑制癌細胞生長。此外，EACG 調節細胞週期蛋白表達和絲裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 訊號通路，有利於抑制癌細胞存活。總而言之，目前的研究強調了一個證據，即在 HCC 中，EACG 在靶向癌細胞存活和誘導細胞凋亡方面優於 EAC。這些研究結果支持 EACG 公式可以作為 HCC 輔助治療的潛在候選者。 -g001.jpg" alt="圖1" />

圖1

牛樟芝孵化與LC–UV…

圖1

牛樟芝孵化與LC–紫外線層析圖。 (A) A. cinnamomea 與或…一起培養。 (A)A. cinnamomea 在有或沒有 1% 生薑的情況下孵育 50 天。使用乙醇分離粗萃取物。 (B) 以 270 nm 紫外光對 EACF、EAC 和 EACG 萃取物進行 HPLC 分析。峰編號對應於表1中所示的天然產物。

圖 2

< p> EAC 和EACG 的影響…

圖2

EAC 和EACG 對Huh-7 和HepG2 細胞活力的影響…

圖2 EAC 的影響和EACG 對Huh-7 和HepG2 細胞活力的影響。 (A,B) MTT 檢測結果顯示 EAC 和 EACG 處理對 Huh-7 和 HepG2 細胞活力的抑制。將細胞暴露於補充 10% FBS 的 DMEM 中所示濃度的 EAC 和 EACG 中 48 小時。數據代表平均值±SD (n = 6)。對照組和實驗組之間的顯著差異以星號標示（***P < 0.01；***P < 0.001）。

圖 3

< p> EACG 改變了細胞​​形態並…

圖3

EACG 改變了Huh-7 細胞的細胞形態和集落形成。 (A) 形態變化...

圖 3 EACG 改變了 Huh-7 細胞的細胞形態和集落形成。 (A) EAC或EACG處理Huh-7細胞48h後的形態變化（相差放大倍率下拍照）。 (B) 用 EAC 和 EACG 處理的 Huh-7 細胞的集落形成測定。 14天后用結晶紫對細胞進行染色。 (C) 長條圖顯示三個獨立實驗的平均菌落數。長條圖為平均值±SD (n = 3)。對照組和實驗組之間的顯著差異以星號標示（***P < 0.01；***P < 0.001）。

圖 4

< p> EACG 誘導G2/M 停滯並…

圖4

EACG 誘導G2/M 停滯和細胞凋亡Huh-7 細胞。 (A) Huh-7 細胞是…

圖 4 EACG 誘導 Huh-7 細胞 G2/M 停滯和細胞凋亡。 (A) Huh-7細胞以50 μg/ml EAC或EACG處理48 h，DAPI染色螢光顯微鏡觀察形態變化。 (B) Huh-7 細胞在含 10% FBS 的 DMEM 中以 50 μg/ml EAC 或 EACG 處理 24 和 48 小時，進行細胞週期分析。用碘化丙啶染色後以流式細胞儀分析細胞週期。 (C) 對用 EAC 或 EACG 處理指定時間點的 Huh-7 細胞進行蛋白質印跡分析。使用針對細胞週期蛋白 A、細胞週期蛋白 B1、細胞週期蛋白 D1、cdc2 和 β-肌動蛋白的抗體對細胞裂解物進行解析和印跡。 (D) 螢光素偶聯的Annexin V和碘化丙啶染色後，以50 μg/ml濃度的EAC或EACG處理Huh-7細胞，進行流式細胞儀分析細胞凋亡。 (E) 長條圖顯示各象限中細胞數量的百分比。 (F) 以 EAC 或 EACG 以 50 μg/ml 濃度處理 48 小時 Huh-7 細胞中的 Caspase-3 活性。列，平均值；條形，SD (n = 3)。對照組與實驗組之間的顯著差異以星號標示（*P < 0.05；**P < 0.01；**P < 0.001）。 (G) 測定凋亡相關蛋白的表達，並以抗 PARP、Bcl-2、Bax、MCL-1、Bcl-xL 和 β-actin 抗體進行印跡。 (H) 對用 EG 處理指定時間點的 Huh-7 細胞進行蛋白質印跡分析。使用針對細胞週期蛋白 A、細胞週期蛋白 B1、細胞週期蛋白 D1、cdc2 和 β-肌動蛋白的抗體對細胞裂解物進行解析和印跡。

圖 5

< p> MAPK 訊息傳遞路徑的調節...

圖5

EAC 和EACG 對MAPK 訊息傳遞路徑的調節。蛋白質印跡分析...

圖 5 EAC 和 EACG 對 MAPK 訊息傳遞路徑的調節。蛋白質印跡分析 EAC 或 EACG 對 MAPK 訊號路徑的時間依賴性影響。 Huh-7 細胞在指定的時間點暴露於含 10% FBS 的 DMEM 中的 50 μg/ml EAC 或 EACG。總裂解物透過針對 ERK1/2、p-ERK1/2、p-JNK、JNK、p38 和 pp38 的抗體進行解析和印跡。

圖 6

< p> A. cinnamomea 的影響...

圖6

A. cinnamomea 子實體(EACF) 對癌細胞活力的影響。 (A)…

圖 6 肉桂子實體 (EACF) 對癌細胞活力的影響。 (A) Huh-7 細胞在補充 10% FBS 的 DMEM 中按指定濃度暴露於 EAC、EACG 和 EACF 48 小時，並透過 MTT 測定評估細胞活力。點，平均值；條形，SD (n = 6)。 (B) EAC聯合EG對Hhuh-7和HepG2細胞活力的影響。將細胞暴露於濃度為 0、10、25、50、100、150、200、250 μg/ml 的 EAC、EACG 或 EAC 與 EG。以MTT測定法測定細胞活力。對照組與實驗組之間的顯著差異以星號標示（*P < 0.05；**P < 0.01；**P < 0.001）。

圖 7

< p> 描繪效果的建議圖表...

圖7

描繪EACG 對細胞週期、MAP 激酶和細胞凋亡的影響的建議圖表…

圖7描繪效果的建議圖表EACG 對細胞週期、MAP 激酶和凋亡訊號路徑的影響。透過與生薑共孵育誘導AC次級代謝產物的改變。這些訊號網絡在不同細胞層面的相互作用導致 EACG 能夠誘導 Huh-7 細胞中 subG1/G2M 停滯和凋亡。 所有人物 (7)