來自枯草芽孢桿菌 ATCC 6633 的尿苷二磷酸依賴性糖基轉移酶催化靈芝酸 A 的 15-O-糖基化
摘要
枯草桿菌 ATCC（美國典型培養物保藏中心）6633 被發現可以生物轉化靈芝酸A (GAA)，這是一種主要的羊毛甾烷三萜類化合物來自藥用真菌Ganoderma lucidum。此細菌的5個糖基轉移酶家族1（GT1）基因，包括兩個尿苷二磷酸依賴性糖基轉移酶（UGT）基因，BsUGT398和BsUGT489，在中被克隆和過度表現。超高效液相層析證實兩種純化的UGT蛋白將靈芝酸A生物轉化為代謝物，而其他三種純化的GT1蛋白則不能生物轉化GAA。 BsUGT398 和 BsUGT489 的最佳酵素活性在 pH 8.0、鎂或鈣離子為 10 mM 時。此外，沒有候選者表現出對antcin K的生物轉化活性，antcin K是來自牛樟芝子實體的主要麥角甾烷三萜類化合物。然後用製備型高效液相層析法從每種 BsUGT 酵素中分離出一種生物轉化的代謝物。透過質譜和核磁共振波譜分析，從每個 BsUGT 分離出的代謝物被鑑定為靈芝酸 A-15-O-β-葡萄糖苷。本研究中的兩種BsUGT 是首次鑑定的催化三萜類化合物15-O-糖基化的酵素。 src=" /zb_users/upload/2024/12/ijms-19-03469-g001.jpg" alt="圖1" />
圖1
靈芝酸A的生物轉化… < /p>
圖1
B. subtilis ATCC 生物轉化靈芝酸A (GAA)（美國典型培養物…
圖1 B.subtilis ATCC 生物轉化靈芝酸A (GAA)枯草桿菌 ATCC（美國典型培養物保藏中心）6633。以超高效液相層析（UPLC）分析發酵液的初始培養（虛線）和72小時培養（實線）。 UPLC 操作條件在材料和方法部分中描述。
圖2
< p> BsGT 的分子系統發育分析…圖2
用最大似然（ML）方法推斷的BsGT 候選者的分子系統發育分析。 2 分子系統發育分析使用最大似然 (ML) 方法推斷的 BsGT 候選數。最適合的 ML 模型選擇是 mtREV24 [23]。顯示了具有最高對數似然 (−6498.11) 的樹。相關分類群聚集在一起的樹木的百分比顯示在樹枝旁邊。透過將鄰居連接和 BioNJ 演算法應用於使用 JTT 模型估計的成對距離矩陣，然後選擇具有優越對數似然值的拓撲，自動獲得啟發式搜尋的初始樹。該樹是按比例繪製的，分支長度以每個位點的替換數量來衡量。分析涉及 10 個胺基酸序列。所有站點覆蓋率低於95%的職位均被淘汰。也就是說，任何位置都允許少於 5% 的比對間隙、缺失資料和不明確的鹼基。最終資料集中共有 372 個位置。在 MEGA X 中進行了進化分析[24]。 
圖3
< p> 純化的GAA 生物轉化...圖3
純化的BsUGT398 ( a ) 或BsUGT489 ( b... < /p> b>
圖3 純化的BsUGT398 (a) 或BsUGT489 (b) 對GAA 的生物轉化將2 微克純化的BsUGT398 或BsUGT489 與0.4 mM 尿苷一起孵育。中所述。
圖3
< p> 純化的GAA 生物轉化...圖3
純化的BsUGT398 ( a ) 或BsUGT489 ( b... < /p> b>
圖3 純化的BsUGT398 (a) 或BsUGT489 (b) 對GAA 的生物轉化將2 微克純化的BsUGT398 或BsUGT489 與0.4 mM 尿苷一起孵育。中所述。
圖4
< p> pH 值的影響( a…圖4
pH 值的影響( a , b ), 溫度( c , d…
圖4 pH 值的影響(a,b< /b >)、溫度(c,d) 和BsUGT398 上的金屬離子(e,f) (< b>a、c、e）或BsUGT489（b、d、< b> f) 標準條件設定為 50 mM Tris 中含有 2 µg 純化酶、1 mg/mL GAA、10 mM MgCl2 和 10 mM 尿苷二磷酸 (UDP)-葡萄糖。 °C。為了確定最佳反應條件，將標準條件下的pH、溫度或金屬離子替換為測試條件。相對活性是將UPLC曲線中反應產物峰的總面積除以標準條件下反應的產物峰面積來獲得。顯示平均值 (n = 3)，並以誤差線表示標準差。
圖4
< p> pH 值的影響( a…圖4
pH 值的影響( a , b ), 溫度( c , d…
圖4 pH 值的影響(a,b< /b >)、溫度(c,d) 和BsUGT398 上的金屬離子(e,f) (< b>a、c、e）或BsUGT489（b、d、< b> f) 標準條件設定為 50 mM Tris 中含有 2 µg 純化酶、1 mg/mL GAA、10 mM MgCl2 和 10 mM 尿苷二磷酸 (UDP)-葡萄糖。 °C。為了確定最佳反應條件，將標準條件下的pH、溫度或金屬離子替換為測試條件。相對活性是將UPLC曲線中反應產物峰的總面積除以標準條件下反應的產物峰面積來獲得。顯示平均值 (n = 3)，並以誤差線表示標準差。
圖5
< p> GAA 的生物轉化過程...圖5
BsUGT398 或BsUGT489 的GAA 生物轉化過程。
圖5 BsUGT398或BsUGT489生物轉化GAA的過程。 所有人物 (7)