Ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol 減輕腦出血引起的腦損傷和 BV-2 小膠質細胞激活

摘要

腦出血（ICH）是一種破壞性神經系統疾病，其特徵是神經發炎和神經元損傷加劇，目前幾乎沒有有效的治療方法。據報道，抑制過度的神經膠質細胞活化可以減輕與腦出血相關的腦損傷。在本研究中，亞洲藥草牛樟芝的生物活性成分ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol (EK100)的抗ICH活性和小膠質細胞機制，進行了評估。 EK100 治療後可顯著減輕膠原蛋白酶誘導的 ICH 小鼠模型中的神經行為缺陷和 MRI 相關腦損傷。此外，EK100 減輕了同側腦區環加氧酶 (COX)-2 的誘導表現和基質金屬蛋白酶 (MMP)-9 的活性。結果一致表明，EK100 濃度依賴性地抑制 Toll 樣受體 (TLR)-4 活化劑脂多醣 (LPS) 活化的小膠質細胞 BV-2 和原代小膠質細胞中 COX-2 蛋白的表達。此外，EK100 也減弱了小膠質細胞前列腺素 E2 和活性氧的產生。 EK100 也減弱星狀細胞 MMP-9 活化的誘導。在多種訊號路徑中，EK100 顯著且濃度依賴性地抑制 LPS 活化的小膠質細胞 BV-2 細胞中 c-Jun N 端激酶 (JNK) MAPK 的活化。一致地，體內 ICH 處理後的 EK100 顯著抑制同側 JNK 活化。總之，EK100對小鼠ICH模型中的小膠質細胞JNK活化發揮抑製作用，並減弱腦COX-2表現、MMP-9活化和腦損傷。因此，EK100可能被提議並用作腦出血的潛在治療劑。 g001.jpg" alt="圖1" />

圖1

ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol (EK100) 的效果關於…

圖1

ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol (EK100) 對腦出血後神經行為缺陷與神經影像異常的影響… < /p> 圖 1 ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol (EK100) 對體內腦出血 (ICH) 後神經行為缺陷和神經影像異常的影響。 C57BL/6 小鼠在紋狀體內注射 0.02 U 膠原蛋白酶後 30 分鐘口服 EK100 (30 mg/kg) 或載體以誘導 ICH。 (A) 顯示了 EK100 的化學結構。 (B) 神經行為缺陷評估分數顯示為 24 小時後所有六項單獨測試分數 (n = 8)。評估在方法部分中有詳細描述。 (C) 以媒介物或 EK100 (30 mg/kg) 治療 ICH 後 24 小時的 T2 加權 MRI 及其非 ICH 對照。 (D) 長條圖顯示了所表達的病變指數，如材料和方法中詳述。數值表示為平均值±SD (n = 4)。 ###p <與同側NS（生理食鹽水）-紋狀體注射賦形劑治療組比較為0.001； * p < 0.05，***p＜0.05與同側膠原蛋白酶紋狀體注射媒介物治療組（ICH）相比為0.001。圖示了用於評估腦損傷的門控位點。

圖2

< p> EK100 對…的影響

圖2

EK100 對…後腦COX-2 和iNOS 蛋白表現的影響

圖2 EK100 對…的影響ICH後腦COX -2和iNOS蛋白的表達。 C57BL/6 小鼠在紋狀體內注射 0.02 U 膠原蛋白酶後 30 分鐘口服 EK100 (30 mg/kg) 以誘導 ICH。 ICH後24小時獲得腦切片（3 mm），將其同側（I）和對側（C）區域勻漿並分析COX-2的表達（A，n = 6 ) 和iNOS (B, n = 5) 蛋白（以蛋白質印跡法檢測）。相對變化（倍數）表示為平均值±SD。 ###p <與同側NS-紋狀體注射賦形劑治療組比較為0.001； * p <與同側膠原蛋白酶紋狀體注射賦形劑治療組相比為0.05。

圖3

< p> EK100 對…的影響

圖3

EK100 對… ICH 後腦MMP-9 明膠分解活性的影響

圖3 EK100 對…的影響體內ICH後腦MMP-9的明膠分解活性和體外膠原酶VII的活性。 (A) C57BL/6小鼠紋狀體注射0.02U膠原蛋白酶後30分鐘口服EK100 30mg/kg誘導ICH。 ICH後24小時獲得腦切片（3mm），並使用酵素譜法評估同側（I）和對側（C）區域的腦組織勻漿的MMP-9活性。相對變化（倍數）表示為平均值±SD (n = 5)。 ###p <與同側NS-紋狀體注射賦形劑治療組比較為0.001； * p <與同側膠原蛋白酶紋狀體注射賦形劑治療組相比為0.05。此標記物表示為來自 HT1080 細胞培養基的 MMP-9 介導的明膠分解的陽性對照。 (B) 使用膠原蛋白酶 VII 的酵素單位（0.02 和 0.04 U）以明膠酶譜法體外評估其催化活性。將 EK100 (50 μM) 及其媒介物 (V) 或陽性對照（EDTA，2 mM）及其媒介物 (NS) 添加到具有操作凝膠的反應緩衝液中，如方法部分所述。相對變化（倍數）表示為平均值±SD。 ###p <與體外媒介物處理條件相比為 0.001。

圖4

< p> EK100 對…的影響

圖4

EK100 對LPS 誘導的小膠質細胞中COX-2 蛋白表現的影響…

圖 4 EK100對LPS 誘導的小膠質細胞BV-2 和原代小膠質細胞中COX-2 蛋白的表達以及PGE2 和ROS 的產生進行影響。 (A) 將 BV-2 細胞 (2 × 105 cells/mL) 分配到 6 孔板上，並以不同濃度的 EK100 (0.5、1、5 和 10 μM) 或媒介物 (V ) 15 分鐘，然後用LPS (150 ng/mL) 刺激24 小時。然後，獲得細胞裂解物並透過蛋白質印跡分析COX-2蛋白表現。相對變化（倍數）表示為平均值±SD (n = 3)。 (B) 將原代小膠質細胞分配到6 孔板上，並以不同濃度的EK100（1 和10 μM）或載體處理15 分鐘，然後用LPS (150 ng/mL)刺激24 h. COX-2 蛋白表現的相對變化（倍數）表示為平均值±SD (n = 4)。 (C)以ELISA評估BV-2細胞條件培養基中PGE2的含量。對數值進行分析並表示為平均值±SD (n = 3)。 (D) BV-2 細胞以載體或 EK100 (5、10 和 20 μM) 預處理 30 分鐘，然後以 LPS (150 ng/mL) 刺激 24 小時。刺激後，購買 BV-2 細胞並與 DCFH-DA 一起孵育 40 分鐘。然後，透過流式細胞儀（BD AccuriTM C6，新澤西州，美國）分析細胞 DCF 螢光強度。對結果進行分析並表示為平均值±SD (n = 3)。 ###p <與靜止組相比為0.001（R）； * p < 0.05，**p＜0.05 0.01，***p＜0.01與刺激下的車輛相比為 0.001。

圖 5

< p> EK100 對LPS-... 的影響

圖5

EK100 對星狀細胞中LPS 和凝血酶誘導的MMP-9 活化的影響。大鼠原代...

圖 5 EK100 對星狀細胞中 LPS 和凝血酶誘導的 MMP-9 活化的影響。大鼠原代星狀細胞以載體(V) 或EK100（1、5 和10 μM）預處理，並以(A) LPS (500 ng/mL) 或( B ) 凝血酶 (10 U/mL) 24 小時，如圖所示。然後以明膠酶譜法測定無細胞上清液的 MMP-9 活性。光密度數據的相對倍數顯示為平均值±SD（n = 3和4）。 ###p <與靜止組相比為0.001（R）； * p < 0.05，**p＜0.05與刺激下的車輛相比為0.01。

圖6

< p> EK100 對…的影響

圖6

EK100 對BV-2 細胞中LPS 誘導的IκBα 降解的影響。 Western…

圖 6 EK100 對 BV-2 細胞中 LPS 誘導的 IκBα 降解的影響。蛋白質印跡分析證明 (A) BV-2 細胞中 LPS 誘導的 IκBα 降解的時間過程。將細胞 (2 × 105 個細胞/mL) 分配到 6 孔板上，並依照指示分別以 LPS (150 ng/mL) 刺激 5、15、30、45 和 60 分鐘。數據顯示為平均值±SD (n = 3)。 #p < 0.05，##p＜ 0.01，###p <與休息組 (R) 相比為 0.001。 (B) BV-2 細胞 (2 × 105 個細胞/mL) 以 EK100 (0.5、1、5 和 10 μM) 或載體 (V) 預處理 15 分鐘，並以 LPS (150 ng /mL) 45 分鐘。取得細胞裂解物並使用蛋白質印跡方法以特異性 IκBα 抗體進行分析。數據顯示為平均值±SD (n = 3)。 #p <與靜止組相比為0.05（R）； * p < 0.05，**p＜0.05與刺激下的車輛相比為0.01。

圖7

< p> EK100 對LPS 誘導的影響...

圖7

EK100 對BV-2 細胞中LPS 誘導的MAPK 活化的影響。 BV-2 細胞 (2…

圖 7 EK100 對 BV-2 細胞中 LPS 誘導的 MAPK 活化的影響。將 BV-2 細胞 (2 × 105 個細胞/mL) 分配到 6 孔板上，並以EK100（0.5、1、5 和10 μM）或載體(V) 15 分鐘，然後以LPS (150 ng/mL) 刺激指定時間（ERK 和p38 為30 分鐘；JNK 為45 分鐘）。分析磷酸化ERK (1/2) (A)、p38 (B) 和JNK (C)與靜止組相比， MAPK 的相對變化（倍數）表示為平均值±SD（n = 4），###p < 0.001。 p> 圖8

EK100 對…的影響

圖8

EK100 對p 大腦層面的影響-JNK和p-ERK MAPK蛋白…< /p> 圖8 EK100對ICH後腦內p-JNK和p-ERK MAPK蛋白量的影響。 C57BL/6小鼠在紋狀體內注射0.02U膠原蛋白酶後30分鐘給予載體或口服劑量30mg/kg的EK100以誘導ICH。 ICH後24小時取得腦切片（3 mm），分析其同側（I）和對側（C）區域的p-JNK表達（A，n = 4）和透過蛋白質印跡檢測p-ERK (B, n = 4) 蛋白。相對變化（倍數）表示為平均值±SD。 ###p <與同側NS-紋狀體注射賦形劑治療組比較為0.001； *** p <與同側膠原蛋白酶紋狀體注射媒介物治療組（ICH）相比為0.001。 所有人物 (8)